给大家分享的是最近在JACS上发表的文章，题为：Live-Cell Protein Modification by Boronate-Assisted Hydroxamic Acid Catalysis。该工作的通讯作者是来自东京大学医药研究生院的Shigehiro A. Kawashima教授、Kenzo Yamatsugu教授和Motomu Kanai教授。

真核细胞内的许多过程都受到蛋白质的翻译后修饰(PTMs)所调控，包括信号转导、酶活性和转录等等,，因此在活细胞内选择性地进行PTMs是研究其功能的有利方法。其中非生物催化是一种不需要基因操作、且能提供最广泛的非天然PTMs的方法，但目前实现有用的反应性和选择性仍是一个未解决的挑战。

在之前的工作中，该课题组报告了DSH的催化剂系统，能够实现区域选择性的蛋白质赖氨酸的酰化(如图1a)。然而将其应用于活细胞时，细胞内高浓度的硫醇会导致硫酯的中间体猝灭，因此反应过程中需要用 GSH 生物合成抑制剂和毫摩尔级浓度的硫酯试剂处理细胞。

为了解决这个问题，作者在本文中报告了硼酸盐辅助的羟肟酸 (BAHA) 的催化体系(如图1b)。在该设计中，二醇与含硼酸的酰基供体可逆结合以形成硼酸酯，随后由于局部浓度的提高，迅速地向路易斯碱发生分子内的酰基转移，产生了反应中间体。通过选择性优化含硼酸的酰基供体和二醇化合物，得到最优的赖氨酸酰化产率，并将其应用到活细胞内的蛋白质修饰。

图1. (a)使用硫酯交换的DSH催化剂系统;(b)利用可逆硼酸盐的形成的BAHA催化剂体系

作者首先通过HPLC评估了不同的酰基供体，最后选择D2作为乙酰化试剂，因为它更倾向于酰胺化反应而不是硫酯的形成。随后作者以先前报道的羟肟酸路易斯碱与赖氨酸残基和二醇的共价偶联物作为模型底物，调整了不同的催化剂结构，进而在D2的存在下通过HPLC检测赖氨酸的乙酰化过程。结果表明硼酸盐的形成和路易斯碱的催化对有效乙酰基转移反应起到协同作用，二者缺一不可。 

基于此，作者合成了催化剂6，它配备了甲氧苄啶 (TMP)，这是一种大肠杆菌二氢叶酸还原酶 (eDHFR)的配体(如图2)。在6和D2的存在下，eDHFR-GFP成功地实现了位点特异性(K32)的乙酰化。此外，该反应可耐受各种潜在的抑制剂，包括5 mM GSH、HeLa细胞质提取物、多巴胺、D-果糖和20当量的反应副产物。

图2. eDHFR K32的体外乙酰化反应。反应条件：10μM eDHFR-GFP, 2μM 6, 0.2mM的D2, 50mM磷酸盐, pH 7.5, 37℃, 4小时

接下来，作者使用重组表达的eDHFR-GFP(细胞内约 30 μM)作为靶标，在活细胞HEK293T中测试了BAHA系统的乙酰化反应性。不幸的是，在5 μM 6和100 μM D2存在下，5小时后仅得到了22%的乙酰化反应产物。作者认为这是由于催化剂6的高亲水性和分子量可能会损害其药代动力学方面的性质，例如膜渗透性或代谢稳定性。因此作者合成了更加疏水的催化剂，结果产量得到了大大的提高，且间位的催化剂的产率最高(80%)，然而其中缘由作者尚不清楚。

图3. HEK293T细胞内eDHFR-GFP酰化的范围。反应条件：1 μM 8, 100 μM 酰基供体, 37 °C, 5小时

最后，作者在HEK293T细胞中探究了BAHA系统介导的赖氨酸酰化的酰基供体范围(如图3)。结果显示，内源性的PTM的产率都很高——乙酰基(D4;82%)和丁酰基(D5;79%)。带有炔烃(D6;74%)和叠氮化物(D7;72%)反应性手柄的酰基供体也得到了很高的产率;此外，带有光反应性二氮嗪基团(D8;69%)的供体也是有效的，含硫醚的供体(D9)的酰化也以63%的产率实现，链霉亲和素(D10;62%)、含氟化合物(D11;49%)、低聚乙二醇(D12;52%)的酰基也是可能的。然而含有带电官能团的酰基供体不成功，可能是由于膜渗透性低。

综上所述，作者开发了一种用于活细胞内蛋白质赖氨酸酰化的BAHA催化剂系统。BAHA的催化剂和试剂相互作用，使其可以以微摩尔浓度反应，且具有良好的选择性，不受细胞内的GSH 影响，提供了一种在活细胞中安装天然和非生物赖氨酸 PTM 的方法。

作者：LJH    审校：ZZC

DOI: 10.1021/jacs.1c07060

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c07060