给大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的工作，题为：Oligonucleotide Bioconjugation with Bifunctional Palladium Reagents。该工作的通讯作者是来自Massachusetts Institute of Technology的Bradley L. Pentelute教授与Stephen L. Buchwald教授。

寡聚核苷酸与蛋白质的生物偶联反应对于发展新型检测、体内成像和诊疗方法具有重要意义。新型治疗药物和传感器的实现需要生物偶联物的具有均一的结构与组成，然而生物分子上众多竞争性活性基团的存在，使得快速和选择性偶联的实现具有较大挑战性。一种有效方法是将叠氮化合物或炔基衍生化的非天然氨基酸引入蛋白质中，通过叠氮-炔环加成反应实现位点特异性偶联，但是将非天然氨基酸整合到蛋白质底物中通常具有一定的挑战性。作者之前的工作展示，高反应活性的钯试剂能够在高稀释条件下在体外和体内选择性地进行蛋白质偶联。但受限于活性寡核苷酸钯试剂构造的困难，目前尚没有通过该方法制备寡核苷酸与天然多肽或蛋白质偶联物的报道。Suzuki – Miyaura，Sonogashira和Stille-Migita交叉偶联已经被用来对卤代寡核苷酸进行官能化，但上述反应通常需要使用过量的反应物、有机共溶剂，以及高温(图1)。因此，将上述交叉偶联策略扩展到温和条件下的寡聚核苷酸偶联反应体系仍然是一个挑战。本文中，作者借助一种双功能钯(II)试剂OACs实现了第一例能够稳定储存的寡聚核苷酸钯试剂，并且实现了寡聚核苷酸与一系列生物分子的的水相原位偶联。

图1. 钯催化的寡聚核苷酸偶联反应

具体来说，如图2所示，作者通过在钯试剂的配体上引入亲水性磺酸基团，有效提升了双官能钯试剂的水溶性，进而通过钯试剂上的活化酯与氨基修饰核苷酸分子O1间的酰胺化反应在低浓度水相中实现了寡聚核苷酸钯试剂的制备。随后无需纯化，向体系中加入巯基丙酸模型小分子，即可在室温下原位生成含硫醚键的核苷酸-小分子偶联物O1-MPA。对照实验显示5’端未修饰氨基的寡聚核苷酸则不能发生上述反应，表现处偶联反应的高位点选择性。

图2. 钯试剂的筛选及寡聚核苷酸偶联物的一锅法制备

作者也指出除了通过一锅法完成偶联反应之外，寡聚核苷酸钯试剂O1-OAC也能被单独合成出来，并通过HPLC进行高效纯化（图3）。同时该试剂对空气具有较好的稳定性，能够在室温下长期储存，用于与不同的生物分子进行偶联。

图3. O1-OAC的纯化与表征

接下来作者设计了一种含有半胱氨酸的多肽分子Z33-N17C，将Z33-N17C与O1-OAC在PBS缓冲液中混合反应30分钟即可以~93%左右的高产率获得偶联物，偶联物的结构也为质谱所证实。5’端修饰有巯基的核苷酸与O1-OAC也可以在高稀释条件下的实现转化完全的偶联反应（图4）。

图4. 寡聚核苷酸与多肽/核苷酸的偶联反应

作者也展示了O1-OAC能够与曲妥珠单克隆抗体（Her2）发生快速偶联，通过加入TCEP还原剂将抗体分子中的二硫键还原为巯基，抗体轻链与重链可同时与O1-OAC进行偶联，所获得的偶联物仍然保持与重组Her-2蛋白质的亲和能力（图5）。上述结果共同展示分子O1 OAC可以在亲核基团存在的情况下特异性的与多种类型的含巯基生物分子发生高效的位点特异性偶联反应。

图5. 寡聚核苷酸与单克隆抗体偶联物制备与表征

最后，如图6所示，作者尝试将含巯基生物分子同时与等当量的O1 OAC 与带马来酰亚胺端基的寡聚核苷酸混合反应，发现前者相应的产物是后者的三倍，表明钯催化的偶联反应活性高于经典的马来酰亚胺/巯基体系。

图6. 寡聚核苷酸偶联反应的选择性

总的来说，作者开发了一种利用双功能钯(II) OACs制备寡核苷酸生物偶联物的新方法。该方法通过酰胺化反应在双功能OAC和功能化寡核苷酸之间进行位点选择性反应，生成活性高的寡核苷酸OAC。寡核苷酸OAC可以被分离纯化并用于与包括多肽、曲妥珠单抗和寡聚核苷酸等在内的含硫醇生物分子的C-S芳基化偶联。该方法具有化学选择性高、反应速度快、收率高等优点，有望在新药开发等领域发挥重要作用。

作者：XW    审校：WGQ

Jbara, M.; Rodriguez, J.; Dhanjee, H. H.; Loas, A.; Buchwald, S. L.; Pentelute, B. L., Oligonucleotide Bioconjugation with Bifunctional Palladium Reagents. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60 (21), 12109-12115.

Link: https://www.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202103180