今天给大家分享一篇最近发表在JACS上的研究，题为：Chemoselective Copper-Mediated Modification of Selenocysteines in Peptides and Proteins，文章的通讯作者是希伯来大学的Norman Metanis教授。

图1. 本文与此前研究的对照

对蛋白质的选择性修饰一直是化学生物学等基础学科的重要研究内容，对于深入了解蛋白质功能以及药物等发展具有重要的意义，人们此前已经发展出了许多化学工具对蛋白质上的不同残基进行选择性修饰。硒代半胱氨酸（selenocysteine, Sec）被认为是第21种氨基酸，相比于半胱氨酸，Sec侧链的硒原子具有更高的亲核性以及更低的pKa，对于一些蛋白的活性以及结构都扮演了重要的角色，Pentelute，Buchwald等人都曾经报道过对其选择性修饰，然而大多数工作都在较为简单的多肽体系中进行，并不存在高活性官能团（比如二硫键）。此前作者发展了利用二价铜离子对硒代脯氨酸脱保护的化学策略，他们推测Cu(II)能够作为路易斯酸与硒原子结合，同时有报道显示Cu(II)能够氧化肼产生自由基，鉴于硒的高单电子反应活性，作者推测能够利用Cu(II)与肼通过自由基的方式对Sec进行高选择性修饰。

图2. 该修饰策略对于肼结构的容忍性

为了验证这一假设，作者首先合成了模型多肽TFUGK-NH₂（二聚体），将其与3,5-二甲基苯肼反应，在1 eq硫酸铜的存在下即可实现高达95%的转化率。随后，他们探究了肼结构对转化率的影响。结果显示（图2），对于苯肼而言，常见的吸电子与供电子取代基都不会对转化率产生太大的影响，但是当使用极为缺电子的的五氟苯肼时，转化率有明显的下降；除芳肼外，烷基肼也能够实现选择性修饰。

图3. EPR结果与可能的修饰机理

接下来，作者通过电子顺磁共振（EPR）对反应机理进行了研究（图3）。在多肽与苯肼的反应体系中，他们观察到了苯基自由基的存在。他们使用含Se（图3b），含硫（图3e）与不含硫/硒的多肽（图3d）进行了测试，结果显示含硒多肽体系产生了最强的信号，并且信号强度与加样顺序也有相关性。这说明硒原子可能以某种方式与苯自由基发生了作用，使其更加稳定，有利于反应的进行。硫原子能够部分稳定苯自由基，而对照多肽对自由基的稳定性极差。根据以上现象，作者提出了可能的机理（图3）：首先肼被Cu(II)氧化为自由基，并与二硒键产生作用，并随后形成产物，产生的硒自由基则重新形成二硒键进行下一步反应，Cu(I)则被氧气氧化继续进行反应。

图4. 化学选择性的研究

作者进一步对该反应的化学选择性进行了细致的研究（图4）。他们发现，虽然多肽上的半胱氨酸/甲硫氨酸也能够被修饰，但是该副反应效率极低，并需要较长的时间（2-18h），而Sec的修饰效率在10min内即可完全。为了避免对甲硫氨酸等氨基酸产生氧化，他们除去了体系中的氧气并增加了硫酸铜的量。酶解等实验显示，该反应对大多数氨基酸侧链均没有反应活性。随后他们对更为复杂的蛋白体系展开了尝试（图5），在合成了硒代泛素（G47U）后，实验显示该方法能够对泛素实现定量、选择性的生物素化（图5）；进一步在含有二硫键的蛋白SDF1(S25U)上的尝试亦取得了成功。

图5. 对泛素的选择性修饰

总结来说，作者发展了一种铜介导的硒代半胱氨酸的修饰方法，该方法对硒代半胱氨酸具有较高的选择性，适用于多肽与蛋白的体系，有望在含硒蛋白的功能性研究中发挥重要作用。

作者：Roy Wu    审校：XW

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c06101

Zhao, Z.; Shimon, D.; Metanis, N., Chemoselective Copper-Mediated Modification of Selenocysteines in Peptides and Proteins. J Am Chem Soc 2021, 143 (32), 12817-12824.