分享一篇发表在Nature Communications上的文章，题目为“Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates”。本文通讯作者为北京大学药学院的刘涛研究员和北京大学第一医院的杨兴研究员。刘涛研究员课题组的主要研究方向是使用分子生物学的方法开发新型生物治疗药物，以及研究蛋白翻译后修饰的功能。
为了给蛋白质赋予更好的结构和功能多样性用于加速基础研究和转化应用，研究者们努力了很多年来给蛋白质加上荧光素、药物、放射性同位素等等修饰。传统上，这种修饰是通过对蛋白的Cys或Lys侧链进行随机修饰来实现的，但是这种方法特异性不好，无法应用到实际中。而用遗传密码子扩展（GCE）将非天然氨基酸（ncAA）插入到特定位置是一种极具应用前景的方法，利用这种方法，目前已经实现了多种位点特异性修饰的蛋白质疗法。也实现了给蛋白质加入不止一种ncAA，但是产率非常低，操作也十分复杂，因此应用前景不大。本文作者开发了一种ncAA，名为pTAF，同时具有叠氮和四嗪基团，可以分别发生SPAAC反应和TCO反应，这两个反应可以在一锅里进行，但不会互相干扰。为了验证插入pTAF的蛋白质可以被DBCO和TCO自发、正交、高效地标记，他们用anti-HER2-scFv作为模式蛋白，将pTAF插入其中，然后与DBCO-CY5、TCO-PEG3-FITC或者二者均反应，生成HER2-scFv-CY5、HER2-scFv-FITC或者HER2-scFv-CY5-FITC，然后进行SDS-PAGE实验和荧光成像，发现只有HER2-scFv-CY5-FITC中有很强的分子内荧光，表明利用pTAF实现蛋白质的双标记很成功，而且高分辨率完整蛋白质谱分析结果也证明了这两个反应的正交性。之后，作者通过实验分别计算了sfGFP-Y151-pTAF与sTCO-CycP-PEG2-OH的反应速率和sfGFP-Y151-pTAF中N3被封闭时与sTCO-CycP-PEG2-OH的反应速率，实验结果表明两个反应的反应级数一致，说明叠氮与四嗪之间并不会产生太大干扰。
之后，作者利用pTAF实现了NIR染料与PEG偶联到anti-PSMA抗体片段上，用于肿瘤成像；将荧光染料与NOTA（一种螯合剂，可以与64Cu螯合）偶联到anti-PSMA抗体片段，实现了肿瘤的PET成像和荧光图像引导手术；将PEG和MMAE偶联到HER2-scFv上，实现了抗体药物偶联，并连上不同分子量的PEG，改善药物的药代动力学。
总之，作者设计合成了一种带有两个反应基团的ncAA，通过GCE方法可以快速获得高产量的蛋白质双偶联或多偶联物。
本文作者：LZ
责任编辑：WFZ
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-36658-y
文章引用：DOI：10.1038/s41467-023-36658-y
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