分享一篇近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.杂志发表题为“Ultrafast Detection of Monoamine Oxidase A in Live Cells and Clinical Glioma Tissues Using an Affinity Binding-Based Two-Photon Fluorogenic Probe”的研究论文，文章的通讯作者为厦门大学柔性电子（未来技术）研究院黄维教授。单胺氧化酶（MAOs）是哺乳动物中的重要酶，可催化几种神经递质的转化，包括5-羟色胺、多巴胺和苯乙胺。在人体内，MAO有两种异构体，MAO-A和MAO-B，它们在序列上具有约70%的同源性。然而，它们在组织和细胞内分布、底物特异性和酶腔结构方面存在差异。MAO-A在维持神经传递的稳态中起关键作用。MAO-A的异常表达与胶质瘤的发生密切相关，是胶质瘤诊断和治疗的特异性生物标志物。在这项研究中，首先，选择了六个具有深层组织成像能力的双光子荧光团，并在计算机中筛选它们，以通过分子对接识别潜在的命中。有趣的是，结果表明，Pre-mito可以适合MAO-A腔的入口并与周围的Gly443相互作用。为了进一步探索MAO-A空腔，通过吡啶-N连接三种不同的取代基，设计了三个基于pre-mito的探针（CD1-3，图1）。结果表明，3种探针均对MAO-A具有较高的选择性。
图1. 用于MAO-A检测的亲和探针设计与功能化。
此外，吡啶可以增强线粒体的靶向能力。首先使用分子对接评估CD1-3对MAO-A的结合亲和力。如图2A所示，确定了这些探针与MAO腔的距离和部分相互作用。有趣的是，与MAO-B相比，所有3个探针都表现出更大的进入MAO-A腔的倾向，其中CD1在MAO-A中最接近腔底，结合焓最低（计算出的CD1-3结合焓分别为0.9，1.5和20.1 kcal/mol-1）。此外，CD1的氨丙基与MAO-A腔中的Asn181和Tyr191相互作用，促进探针与酶腔的结合。对接结果表明，CD1可能是结合MAO-A的理想亲和结合探针。对所有三个探针进行了时间依赖性荧光分析，正如预期的那样，结果表明CD1与MAO-A的相互作用在20秒内完成（图2B），这是据我们所知最快的MAO-A检测。接下来，添加MAO-A后，所有三个探针的荧光均显着增强，CD1显示出最大的增强，且对MAO-A也表现出优异的选择性（图2C）。接下来，通过添加MAO-A特异性抑制剂氯洛霉素（CL）来评估CD1的检测模型。结果表明，CD1的开启荧光不受CL预处理的影响（图2D）。这些发现表明，CL的存在不会影响CD1对MAO-A的反应。
图2. A）CD1 / MAO-A的对接结果。B）在PBS缓冲液中与MAO-A和MAO-B（0.2 μM）孵育时CD1-3（2 μM）的时间依赖性（0-200 s）相对荧光变化谱。C）在MAO-A或MAO-B（0.2μM）存在下CD1-3（2μM）的相对荧光强度孵育1分钟。D）CL处理或不处理的MAO-A与CD-1的荧光响应。
接下来，使用CD1量化MAO-A并研究它们之间的结合效率。结果表明，CD1的荧光强度与MAO-A的浓度呈线性关系，范围为0至500 nM检测限 = 1.4 nM（图3A）。此外，我们确定了CD1结合常数为3.98×105M-1解离常数为2.51×10-6M（图3B）。这些发现证实了CD1作为MAO-A的高灵敏度探针。进一步测试了CD1与58种常见的干扰，包括阳离子，阴离子，氨基酸，蛋白质，核酸和酶，这些干扰可能会诱发荧光信号的干扰。我们发现CD1的荧光信号仅在MAO-A存在下增加，证明了其对靶标的高选择性（图3C）。在MAO-A存在下，CD1的荧光量子产率（Φ）和双光子作用截面（δTF）增加，表明它可能适用于生物组织中MAO-A的双光子荧光成像（图3D）。
图3. A）与不同浓度的MAO-A（0-0.5μM，1分钟）孵育的CD1（0.5μM）的荧光光谱。B）定量标准曲线。C）CD1（2 μM）在不同分析物存在下的荧光特异性响应。D）PBS缓冲液中CD1和CD1 / MAO-A的光物理性质（pH = 7.4）。
接下来，进一步研究了其在MAO-A含量活细胞成像中的潜力。CD1处理的MAO-A敲除SH-SY5Y细胞发出微弱的荧光，而在CD1处理的MAO-A过表达慢病毒转染HepG2细胞中检测到强烈的荧光信号（图4A&B）。蛋白质印迹进一步证实了每个细胞系中MAO-A的细胞水平（WB，图4C），证明CD1可以选择性地检测活细胞中的内源性MAO-A。由于MAO-A位于线粒体的外膜上，因此确认CD1的准确细胞定位非常重要。将Mito-Tracker Green（MTG，200 nM）与活细胞中的CD1共同孵育，以验证CD1与MAO-A的原位结合。正如预期的那样，来自CD1的强红色荧光信号与来自MTG的绿色荧光信号重叠良好（Person的r = 0.76-0.86，图4A&B）。这些结果表明，CD1可以靶向细胞线粒体，检测内源性MAO-A和活细胞，突出了其在胶质瘤诊断中的潜在应用。作者进一步探索了使用CD1和双光子荧光显微镜（TPFM）在临床胶质瘤和癌旁组织中的MAO-A检测。如图4D&E所示，CD1有效地能够在深部肿瘤组织中对MAO-A进行成像，在CD1处理的人胶质瘤组织中检测到强烈的荧光信号，在CD1处理的癌旁组织中表现出明显较弱的荧光信号。这一观察结果与WB中相应的内源性MAO-A表达水平一致（图4F）。结果表明，CD1具有良好的组织成像能力，可用于胶质瘤中MAO-A含量的快速检测，具有区分肿瘤和癌旁组织的潜力。
图4. A）活SH-SY5Y细胞与CD1（2μM）孵育1小时后的单光子共聚焦荧光图像，MAO-A gRNA1用于敲除内源性MAO-A，Ctrl gRNA用作非靶标对照。B）活HepG2细胞与CD1（2μM）孵育1 h后的单光子共聚焦荧光图像，使用MAO-A POE（蛋白质过表达）载体调节内源性MAO-A，POE Puro作为空载体。C）（A和B）中图像的相对荧光强度。插图：细胞裂解物的相应蛋白质印迹（WB）结果。D）双光子荧光图像（左）和CD1处理（10μM，1小时）人胶质瘤（顶部）和癌旁组织（底部）的内源性MAO-A含量的相应图（右）。E）CD1处理的人胶质瘤（顶部）和癌旁组织（底部）的荧光强度。F）重建组织图像（D）（红色）和插图（蓝色）的相对WB信号的相对荧光强度分布。插图：人神经胶质瘤和癌旁组织的相应WB结果。
综上所述，作者通过计算机筛选和合理设计，成功发现了一种优异的亲和结合基TPFP（CD1）用于快速检测MAO-A。高选择性与TICT效应相结合，制备出超快MAO-A荧光探针，在20 s内完成检测，特异性高，检出限低。活细胞和组织成像实验表明，CD1可以在复杂的生理环境中选择性检测位于线粒体上的内源性MAO-A的含量。虽然CD1不能反映MAO-A酶活性，但其独特的反应机制允许在超短的时间内快速报告MAO-A水平。这种质量使CD1成为快速临床诊断和术中图像引导中快速筛查MAO-A水平的潜在分子工具。
目前评论：