分享一篇发表在Biomacromolecules上的文章，题为：Improving the Therapeutic Potential of G‑CSF through Compact Circular PEGylation Based on Orthogonal Conjugations。本文的通讯作者是来自帕多瓦大学的Gianfranco Pasut。

    在过去的几十年里，通过重组DNA技术生产蛋白质药物在选择性活性、效力和安全性等方面具有突出优势，在多种疗法中发挥了特殊的作用。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）是一种造血细胞因子，于1991年被FDA（Filgrastim）批准用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少症。人G-CSF是一种主要由骨髓间充质干细胞在粒细胞形成过程中产生的糖蛋白。它动员造血干细胞和祖细胞，诱导和调节粒细胞（尤其是中性粒细胞）的增殖、分化和存活。

    G-CSF作为生物药物的主要限制是分子量较低（~18。8kDa），会被肾脏快速清除。因此，聚乙二醇化能够增加其流体动力学尺寸以延长药代动力学。目前，临床实践中有两种聚乙二醇化G-CSF偶联物，一种是通过蛋白质N末端的还原烷基化获得的，而另一种是通过糖聚乙二醇化获得的，即通过酶促方法在蛋白质聚糖部分上进行聚合物偶联。

    本文作者设计了一种双位点特异的PEG环化的策略，使得蛋白质表面的PEG构象更紧凑，从而减少聚合物对蛋白质/受体相互作用过程的干扰（图1A）。为了实现这一目标，作者首先通过还原烷基化在G-CSF的N末端连接了PEG链，然后利用谷氨酰胺转胺酶（mTGase）在K41位点连接PEG链另一端（图1）。

    对于第一步，还原烷基化的选择性依赖于N末端的α-氨基（pKa：6−7）和赖氨酸ε-氨基（pKa：9−10）之间的pKa差异。因此在pH 4.6时，仅有pKa较低的α-氨基仍然具有反应性。对于第二步，使用带有ZQG二肽（带保护的Glu-Gly，mTGae底物）的PEG，可以与G-CSF上的Lys残基反应。在这个过程中，mTGase对赖氨酸有特定的底物要求，只有在柔性区域（loop）的Lys才具有反应活性，而在刚性区域（二级结构）中的Lys无法接触到酶催化位点，从而不具有反应活性。因此，对于G-CSF中的四个赖氨酸来说，Lys17、Lys24和Lys35位于蛋白质的第一个α螺旋中，形成刚性构象。相较之下，Lys41位于第一个和第二个α螺旋的连接处（loop），因此能够作为PEG特异性环化的位点。

图1. 单位点/环状聚乙二醇化示意图及聚合物制备流程

    通过RP-HPLC分析G-CSF与ZQG-PEG20kDa醛的偶连反应，转化率约为73%，并通过阳离子交换柱纯化。SDS-PAGE（分子量~50 kDa）和FPLC验证了偶联物的成功合成，并通过碘染色确定不存在游离PEG（图2）。作者还利用质谱确定了修饰位点是N-末端和Lys41。

图2. 偶联物SDS-PAGE（1&1’: PEG聚合物, 2&2’: G-CSF, 3&3’: 带ZQG的N末端偶联物, 4&4’: 环状偶联物, 5&5’: N末端偶联物, 6&6’: K41偶联物）和SEC-FPLC表征

    随后，作者评估了三种G-CSF偶联物的药代动力学。如图3所示，偶联物的半衰期显著延长。环状偶联物、N末端偶联物和K41偶联物的半衰期分别为G-CSF的5.9倍、5.2倍、3.7倍。环状偶联物cPEGNter/K41-G-CSF表现出最长的半衰期。

图3. 药代动力学表征

    最后，作者探究了G-CSF偶联物的体内活性。G-CSF与特定的细胞表面受体结合后，能够特异性诱导中性粒细胞前体的增殖和分化，并且还能够调节成熟中性粒细胞的存活。因此作者通过比较环状偶联物、N末端偶联物和K41偶联物，对粒细胞和单核细胞水平的影响，来评估它们的体内生物活性。结果表明，单次使用偶联物可导致循环骨髓细胞（尤其是粒细胞）水平显著增加，其水平高于或与每日注射G-CSF效果相当（图4）。与 G-CSF每日注射组或空白对照组相比，环状偶联物在第3天和第5天效果优于线型偶联物，由此证明了环状偶联物对G-CSF与其受体结合的干扰最小。

图4. C57BL/6小鼠血液中骨髓细胞、粒细胞和单核细胞的水平（A—D分别为一/三/五/七天）

    综上所述，本文作者设计了一种双位点特异的G-CSF环状PEG偶联物，相较于线型偶联物展现出了更长的循环时间和更高的体内生物活性，为设计优化蛋白质o偶联物提供了新的思路。

作者: HYH  审校: LXY

DOI: 10.1021/acs.biomac.3c00543

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.3c00543