分享一篇发表在Analytical Chemistry的文章，文章的题目是“Native Ion Mobility–Mass Spectrometry-Enabled Fast Structural Interrogation of Labile Protein Surface Modifications at the Intact Protein Level”，文章的通讯作者是来自威斯康星麦迪逊分校的李灵军老师和南开大学化学学院的李功玉老师，李灵军老师是著名的基于质谱的蛋白质组学专家，曾开发了多重同位素定量标签DiLeu，李功玉老师主要研究蛋白质结构质谱分析化学，后者也曾在前者的实验室进行了博后研究。蛋白质唾液酸化修饰涉及多个生物学过程，例如增强细胞毒性、抑制信号通路活性，并与多种包括阿尔茨海默病AD、帕金森等重要疾病相关。在AD中转铁蛋白TF已经被报道，其唾液酸化水平变化可能影响大脑中的铁稳态，因此了解唾液酸化TF与AD的关系非常重要，但目前人们只知道唾液酸化会影响TF的结构和二聚。2018年Robinson课题组在使用非变性质谱研究N糖修饰时曾发现，带有负电的唾液酸化修饰可能通过位阻或与蛋白质骨架的直接作用影响聚糖的取向。最近也有研究使用离子淌度质谱(IM-MS)发现免疫清除蛋白的稳定性与其糖基化位点数量紧密关联，其中包括大脑中常见的唾液酸来源Neu5Ac。因此作者希望研究唾液酸化修饰是如何调控TF发挥细胞铁转运功能、相互作用和下游功能。TF介导的细胞铁转运主要是通过TF受体的內吞作用和载铁TF的内化，与Fe3+结合的TF被TF受体內吞进内小体，其中部分铁被还原成Fe2+，然后Fe3+和Fe2+被从TF中释放进入胞质，空载TF则被外排到胞外进入下一轮循环。作者首先通过细胞毒性实验和离子淌度质谱发现，唾液酸化TF会增加细胞毒性，且其对Fe和Aβ蛋白均具有高亲和力，因此作者提出Aβ也可以与TF结合，通过内吞作用进入细胞。进一步的细胞实验作者证明了Aβ和Fe3+的共处理会进一步增强细胞毒性，但IM-MS证明Aβ会优先结合Fe2+而不是Fe3+，因此作者认为是Fe3+和Aβ被同时转运进细胞，其中Fe3+被还原后再与Aβ结合形成有毒的低聚物。作者进一步设计细胞实验对这种细胞毒性的来源和两种不同的唾液酸化来源Neu5Ac、Neu5Gc进行了比较，结果显示细胞毒性来自多个细胞过程，包括唾液酸化TF的Fe过载、Aβ寡聚和Aβ与胞内Fe2+结合。此外相比于Neu5Gc，Neu5Ac形成的唾液酸化则对维持细胞活力更有利，且过量修饰导致的细胞毒性也较低。随后作者通过IM-MS和其他生物物理技术分析了不同唾液酸化模式(Neu5Gc/Neu5Ac)对TF结构影响的不同。作者首先通过全离子碎裂的AIF IM-MS分析了化学稳定性，Bottom-Up的蛋白质组学表明人的TF全部为Neu5Ac，牛的TF同时携带2种，小鼠的TF则富含Neu5Gc。进一步的梯度碎裂实验表明，Neu5Gc离去所需要的电压(AIF50>145V)要高于Neu5Ac(AIF50~130V)，因此作者证明了TF上Neu5Ac唾液酸化修饰的化学稳定性低于Neu5Gc。基于碰撞诱导去折叠CIU的IM-MS则提供了构象稳定性数据，结果显示Neu5Gc修饰的构象稳定性低于糖蛋白TF上的Neu5Ac修饰，但两者都可以提高TF的构象稳定性。而对TF的拓扑稳定性分析则证明，Neu5Ac和 Neu5Gc唾液酸化均会抑制TF糖蛋白二聚化，但Neu5Gc的抑制作用无法通过唾液酸化释放恢复，但Neu5Ac在唾液酸脱离后成功恢复。综上所述，在本文中作者通过一系列IM-MS实验和细胞毒性实验证明了TF唾液酸化增强了铁相关的Aβ细胞毒性，促进了TF与铁结合，稳定了TF的气相构象，并抑制了TF的二聚化趋势。尽管脑铁输入的机制还未得到证实，但作者的结果已经初步表明，将Neu5Ac维持在一个合适水平，可能作为一种潜在的减缓包括AD在内的唾液酸化糖蛋白疾病的治疗策略。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.1c04503文章引用：DOI：10.1021/acs.analchem.1c04503
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