推荐一篇发表在Chem. Sci.上的文章：An“OFF–ON–OFF” Fluorescence Protein-Labeling Probe for Real-Time Visualization ofthe Degradation of Short-Lived Proteins in Cellular Systems，文章的通讯作者是来自大阪大学的菊地和也与堀雄一郎，他们从事的是化学生物学与生物荧光成像的研究。

      蛋白质降解是维持细胞稳态的重要生命活动，与多种疾病的发生有着密切联系，因此生物学家对于开发研究与调控蛋白质降解的技术有着浓厚的兴趣。已有的研究蛋白质降解的技术包括重同位素氨基酸代谢标记法、环己酰亚胺法等，然而这些方法都存在各种局限性，特别是对于活体内短寿命蛋白(SLPs)的研究不太适用。

      为了解决研究短寿命蛋白降解的问题，作者基于PYP-tag开发了一种“OFF–ON–OFF”探针，用于快速标记PYP-tag融合的目标蛋白。该探针由三部分组成，即一个作为PYP配体的羟基香豆素部分、一个荧光团部分以及一个淬灭团部分，淬灭团与香豆素配体之间是通过不稳定的苯硫酚酯键连接的。当PYP-tag与香豆素配体发生结合时，其表面的Cys69就会进攻这一不稳定的键使淬灭团离去产生荧光；而当PYP-tag被降解后，配体就容易在空间上靠近荧光团使其重新淬灭。

      虽然该探针在原理上可以用于研究蛋白合成与降解，但作者认为要想应用到SLPs上，其与PYP-tag结合的动力学还应得到进一步优化。作者采取的策略是基于经验合理设计PYP-tag的突变体，并且通过动力学实验筛选出了与探针结合的半衰期仅有5 min的突变体。作者又将与探针共价结合的PYP-tag与过量GSH长时间孵育，发现荧光强度没有明显减少，说明探针与PYP-tag结合的硫酯键是相对稳定的，不用考虑GSH破坏结合导致读出错误的蛋白降解信号的问题。

      将探针与tag都优化好了之后，作者依次在体外和体内用蛋白模型验证了探针的效果。作者选择的用于体内研究的SLP是小鼠鸟氨酸脱羧酶MODC，WB显示在加入蛋白合成抑制剂3 h后就已检测不到完整PYP-MODC的存在。作者用荧光探针测出了MODC在体内的的半衰期是107 min，与之前文献报导的数据基本相符。

      综上，作者开发了一种具有快速动力学特征的共价结合荧光探针，用于检测PYP-tag融合的目标蛋白的合成与降解。

本文作者：TZY

责任编辑：Guo ZH

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https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/SC/D1SC06274C

文章引用：DOI：10.1039/D1SC06274C