分享一篇发表在Angew上的文章，文章的题目是“A Chemical Biology Toolbox Targeting the Intracellular Binding Site of CCR9: Fluorescent Ligands, New Drug Leads and PROTACs”，通讯作者是来自德国埃尔朗根-纽伦堡大学FAU的Matthias Schiedel教授，他的实验室主要进行药物开发和G蛋白偶联受体(GPCR)化学工具开发的研究。在这篇文章中作者从一个最近发表的GPCR保守的变构结合位点出发，开发了一个靶向细胞内C-C趋化因子受体9(CCR9)的化学生物学工具箱。
GPCR是药物开发的常见靶点，绝大多数被报道的GPCR小分子配体可以与位于螺旋束内的正构位点结合。最近，通过X-Ray晶体学人们鉴定到另一个在趋化因子受体中高度保守的胞内变构结合位点(intracellular allosteric binding site, IABS)，其可以被小分子拮抗剂结合。以IABS为靶点的小分子配体具有独特的机制，包括稳定非活性受体构象和空间上阻断例如G蛋白和β-抑制蛋白(β-arrestins)与之结合。因此靶向IABS提供了药物设计的新思路，在本文中作者希望将PROTACs技术与之结合，设计一种靶向CCR家族的PROTAC药物。Vercirnon是一种CCR9的拮抗剂，其对CCR9具有高度的选择性，但治疗效果较低，因此需要新方法来提高Vercirnon的药效。另外，目前已有基于放射性氚标记的[3H]vercirnon被开发用于在胞外研究CCR9的变构调节位点，但放射性基团也由于其辐射导致难以推广。因此作者同时也希望开发一种荧光标记的Vercirnon类似物来解决这一问题。
作者首先通过分子对接docking确定在Vercirnon的吡啶环上引入官能团可以不影响其结合功能，作者分别设计了2种TAMRA结合方式，包括烷氧基和基于click反应的三氮唑。为了评估荧光小分子的结合能力，作者开发了一种基于BRET作用的平台：先构建带有纳米荧光素酶Nluc的CCR9，在384孔板中依次加入蛋白和小分子，当带有TAMRA小分子与CCR9结合时，两者会发生BRET作用从而产生光信号。基于此作者筛选出了具有最好Kd的小分子3a。接着作者将该系统搬到了活细胞中，荧光显微镜的结果显示其能很好地穿膜，并与细胞内侧的CCR9结合，且能被Vercirnon竞争，证明了该化合物能使用在细胞实验中。此外作者还基于分子内氢键可能不利于Vercirnon与CCR9结合的假设出发，对Vercirnon的结构进行了优化，得到了结合力更强的先导化合物12，可用于后续研究。
由于作者已经证明了在Vercirnon的吡啶处添加官能团衍生不会影响其变构结合能力，因此作者好奇该变构位点能否适应更大的衍生结构，例如PROTACs。作者选择了Vercirnon原始结构1和优化后的化合物12作为出发，但在化合物12上衍生linker会大大降低结合效果，因此作者还是在化合物1上进行衍生。作者选择了叠氮-化合物1和常见的VHL招募分子AHPC-炔基构建了PROTAC分子13，NanoBRET实验证明了其能以~100nM水平与CCR9结合，ELISA实验也证明了在1-25nM范围内其能以浓度依赖性方式降低CCR9水平。通过加入E1酶抑制剂则可以回补CCR9水平，证明了该过程的确是PROTAC过程。
综上所述，在本文中作者报道了第一个以GPCR变构结合位点为靶点的小分子荧光探针，并通过NanoBRET技术对结合的动力学进行了研究。此外作者还将该系统应用在活细胞中，通过荧光显微镜实现了可视化。最后为了加强CCR9降解，作者成功开发了基于PROTAC的小分子13，为调节GPCR信号转导提供了全新的方法。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202116782原文引用：DOI：10.1002/anie.202116782
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