分享一篇发表在Angew上的文章：Functional Characterization and Protein Engineering of a Triterpene 3-/6-/2’-O-Glycosyltransferase Reveal a Conserved Residue Critical for the Regiospecificity，通讯作者是来自北京大学药学院的叶敏教授和乔雪教授团队，他们的研究方向是天然产物化学及中药药效成分发现、中药化学成分分析与体内代谢、活性天然产物的生物合成和生物催化。
皂苷是一类结构多样的天然产物，具有重要的生物活性。皂苷具有不同的三萜或类固醇骨架，而这些骨架中的糖基化修饰能提高其生物活性和生物利用度。在植物中，糖基化修饰依赖糖基转移酶(GTs)，GTs为糖苷键的形成提供了高效的区域/立体特异性途径。环阿屯烷型（cycloartane-type）皂苷是传统中药黄芪属根部的重要生物活性成分，但该类型的GTs尚未被报道，目前也缺乏三萜GTs的区域选择性设计。在本文研究中，作者为了获得合适的环阿屯烷型三萜GTs，首先分析了黄芪的转录组，并使用其中已鉴定的三萜GTs的5个基因序列去进行BLASTn，获得一个潜在的GT基因AmGT8。为了表征AmGT8蛋白的催化功能，作者在体外表达纯化了AmGT8，并使用黄芪中三萜类化合物的主要形式环黄芪醇（CA）作为底物，UDP-Glc作为糖供体，通过LC/MS和LC/ELSD分析产物，结果显示AmGT8具有三功能糖基转移酶活性，包括一个两步反应：环黄芪醇的3-OH糖基化，产物cycloastragenol-3-O-glycoside后续的2’-OH的糖基化；以及CA的6-OH糖基化。在底物扩展研究中，作者发现AmGT8对于各种三萜类化合物的3-OH, 2’-OH, 和6-OH具有一定的区域特异性性。
接下来，为了进一步提高AmGT8的3-/6-/2’-OH的区域特异性糖基化，作者基于同源建模和分子对接来建立突变体库。从结构上看，AmGT8糖供体和糖受体周围的残基被划分为4个区域，分别为A区（T19, V87, M126）、B区（A394）、C区（S156, P192）和D区（S100, S129, T131, G203），这四个区域可能在底物结合构象中发挥重要作用。于是，作者构建了上述10个氨基酸位点的突变体，并纯化出来进行实验验证，发现几个突变显著改变了区域选择性。在对#394位点的饱和突变中，作者发现A394F突变体具有显著的区域选择性，能产生CA-6-O-glycoside，而A394D突变体具有3-O-glycosylation选择性。另外，T131V突变体具有2’-O-glycosylation选择性。为了进一步解释#394位点的区域选择性机理，作者利用分子动力学和密度泛函理论比较了AmGT8WT和AmGT8A394F催化糖基化的反应活性，发现AmGT8A394F在6-OH时比在3-OH时的结合能更低，故更倾向于在此位点糖基化，也就是说，结合口袋单位点突变影响相对能量并决定了区域特异性。最后，作者联合使用AmGT8的各个突变体，成功合成了黄芪根中主要皂苷类成分——黄芪皂苷III和IV。
综上，本研究报道了第一个植物cycloartane糖基转移酶AmGT8，并通过蛋白质工程实现区域特异性糖基化。原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202113587文章引用：DOI：10.1002/anie.202113587
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