分享一篇JACS的文章，“Multiplexed Screening of Thousands of Natural Products for Protein−Ligand Binding in Native MassSpectrometry”。通讯作者是University of New South Wales的William A. Donald教授，Donald教授主要从事质谱方法开发方向的研究。

      天然产物内在结构的多样性是药物开发的重要来源，但是近些年来在药物发现方面，天然产物的利用却显著下降，主要是由于传统天然产物的药物发现需要生物活性为导向的分离，而天然产物的分离和纯化十分费时费力，与标准的高通量药物发现平台不兼容；此外，生物活性天然产物的鉴定通常依赖于大规模的表型筛选，但筛选后获得的先导化合物作用机制不明，需要进一步深入探究。以上，均阻碍了天然产物药物分子的发现。本文报道了一个天然产物-蛋白质结合筛选平台，将非靶向的代谢组学和多步、高分辨的非变性质谱相结合，直接使用天然产物的粗提物，就能够快速识别与治疗相关靶蛋白结合的天然产物小分子，省去费时费力的天然产物小分子前分离和纯化的过程。

      主要流程如下，获取天然产物粗提混合物，与靶蛋白孵育后，先用一个小体积的凝胶柱对体系进行快速的分离除去未与蛋白结合的化合物。随后，用纳米级的发射器对样品进行非变性的质谱鉴定，通过一级谱即可获知靶蛋白及结合了各种配体的靶蛋白复合物的信息，随后根据m/z对结合了配体的靶蛋白复合物进行分离和活化，让配体和靶蛋白进行解离，再对解离后的配体进行靶向的碎裂和鉴定即可获知与靶蛋白结合的天然产物小分子。

      这个方法在此前难以实现主要是因为对于复杂混合物体系的识别，非变性质谱检测能力有限。复杂混合物体系中的非挥发性分子和盐很容易与蛋白质离子加成，从而拓宽谱峰，并降低信噪比。此前，本文作者改进了离子发射器的孔径，把它缩小到纳米级别（~2000 nm变为~250 nm），有效降低了盐和非挥发性分子与蛋白质复合物的加成程度,提高了检测的信噪比。本文在此基础上还加了一步，即进质谱前对孵育样品进行凝胶柱的快速分离以除去未与蛋白结合的非挥发性化合物，结果显示，这两步操作极大增强了非变性质谱对复杂样品鉴定的分辨能力。作者分别使用红洋葱皮、红三叶草、欧芹、桉树叶、和橘子皮这五种富含黄酮类化合物的植物粗提物进行实验，靶蛋白首先选择的是人碳酸酐酶I (hCAI)，通过这个策略，作者一共鉴定到11个与hCAI结合的配体，Kd值20~370 μM。

      对于所结合配体的鉴定，通过一级谱就能够获知蛋白结合态和未结合态的分子量，相减即可获知配体的分子量，将其与事先获得的植物粗提物的非靶向代谢鉴定结果相比对，就可获得潜在的代谢分子结构。这个平台中三级串联质谱的使用能够帮助提供配体的碎片信息从而进一步确定配体的结构。但是由于该方法当时能够使用的质量分析器检测范围有限，所以有些配体无法被直接检测鉴定，但也可以明确潜在靶点，后续通过对潜在靶点的分离和纯化，再去测定其与靶蛋白的结合能力。

      随后，作者还拓展了靶蛋白的类别，如另外两种碳酸酐酶异构体，以及功能不同的溶菌酶，在此过程中发现了一些这些酶之前未报到过的天然产物配体。综上，这个方法的使用能够有效提高特定靶蛋白天然产物配体的发现进程。

本文作者：CXM

责任编辑：Guo ZH

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https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.1c10408

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DOI: 10.1021/jacs.1c10408