分享一篇Angew上的文章，通讯作者是来自ETH Zürich的Kathrin Lang教授，她们组主要利用密码子拓展技术进行生物学问题研究。
酪蛋白酶P(ClpP)是一类保守的丝氨酸蛋白酶，人源hClpP蛋白酶体定位于线粒体，和氧化损伤和功能失调蛋白的降解有关，其功能异常和Perrault综合征、癌症等多种疾病有关。hClpP会组装成一个内含14个催化活性位点的四聚体，并需要和伴侣ClpX相互作用形成蛋白水解活性复合物，由ClpX识别、结合展开底物，送到ClpP内部进行水解。对ClpP特异性底物的分析能够帮助理解它的功能。此前的工作中也已经有一些方法被开发出来，一是通过在敲除菌中表达活性位点突变的蛋白来捕捉被“困住”的底物蛋白，二是利用BirA或者双功能赖氨酸反应性交联剂的方法进行蛋白酶体底物的临近标记及分析。虽然这些工作提供了部分ClpP底物信息，但是其鉴定时空分辨率不高、无法区别通过ClpP内部的真实底物鉴定。在本文中，作者则利用了非天然氨基酸插入技术实现了通过hClpP的真实底物的分析，并检测了氧化应激条件下的底物变化情况。首先，他们选择使用含最小光交联基团diazirine的非天然氨基酸DiazK以实现在紫外光激活下对周围蛋白底物的交联，并为此筛选出一个PylRS合成酶突变体以实现定点插入。在插入位点选择上，他们基于已有hClpP的晶体结构，选择了6个位于蛋白酶体桶内部并指向中心腔的位置进行插入以实现对不同大小底物的交联，还选择了一个C端位于蛋白表面的K261进行插入以分析hClpP相互作用蛋白。在大肠杆菌中过表达、纯化插入DiazK的蛋白酶体并检测其活性，发现大部分突变体不会明显影响蛋白酶体的活性，两个甘氨酸突变体则可能因为靠近了催化位点而导致活性部分丧失。之后，他们将C端带有富集标签及线粒体定位序列的突变体转入HEK293T细胞，证明了蛋白酶体定位在线粒体上且活性保留，并发现在紫外照射后有多种交联条带出现。他们对这些hClpP的底物进行富集和分析，找到了此前报道过的和TCA循环等相关的一些蛋白，并通过对比插入表面和插入蛋白酶腔的不同突变体的鉴定结果发现两者之间存在部分重叠，说明在腔内插入交联氨基酸以鉴定真实底物的重要性。此外，他们还发现了30种新的hCLpP的底物。最后，作者还测试了在氧化应激条件下hClpP底物的变化情况。此前研究表明在氧化应激是hClpP能够处理损伤蛋白，并通过降解产生活性氧的线粒体呼吸链复合物1来抑制活性氧过度生成。他们利用富集效率最高的D29和K216突变体来通过检测呼吸链复合物1被抑制后hClpP的底物和相互作用蛋白，其中一些定位在线粒体中的蛋白和支链酮酸代谢和RCC复合物调节相关，提示hClpP可能通过多重调控来抵抗氧化应激过程。
总之，作者通过插入光交联氨基酸DiaZK实现了蛋白酶hClpP的底物鉴定。文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202111085文章引用：DOI: 10.1002/anie.202111085
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