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分享一篇发表在ACS Central Science杂志上的文章，题目为“Epitope-Directed Antibody Elicitation by Genetically Encoded Chemical Cross-Linking Reactivity in the Antigen”。文章的通讯作者是来自中科院生物物理所王峰教授，该课题组主要专注于：1）蛋白质工程及大分子药物开发；2）新型抗生素的研发；3）化学生物学/合成生物学。
近年来，小鼠免疫联合下游单克隆抗体的选择已成为识别和开发治疗性抗体的主要途径。然而，这种方法并不总是有效地产生功能性抗体。治疗性抗体必须与靶标的特定表位结合以发挥所需的功能，例如作为拮抗剂阻断配体-受体相互作用或作为激动剂诱导受体介导的下游信号传导。不幸的是，有效表位可能仅占整个靶蛋白的一小部分。通过目前的方法，存在一些问题如，对所需表位抗体反应的可能性小；有些人类靶标与小鼠同系物具有高度相似序列和结构相似性从而出现免疫耐受，难以引发对功能表位的抗体反应。本文主要开发了一种在体内引发表位定向抗体反应的新方法。用AcrK或Kcr掺入的免疫原对小鼠免疫后，抗体反应被定向并富集到靶表位。 Kcr和AcrK（图1A）是赖氨酸类似物，可以通过遗传密码子拓展技术引入到蛋白质中。AcrK和Kcr会与其附近的赖氨酸或半胱氨酸形成共价键。本文中作者首先将AcrK引入到蛋白hIL-1β的E64上，该位点是hIL-1β与Canakinumab（已知的高亲和力抗体）的关键结合位点。IL-1β是一种促炎细胞因子，可与IL1RI和IL1RII结合。阻断IL-1β与IL1RI的结合可以潜在地治疗多种炎症性疾病。根据已发表的方法对雌性小鼠进行抗原免疫后，分离免疫小鼠的脾脏，构建显示抗体单链可变片段（scFv）的噬菌体文库。接下来，针对E64AcrK免疫噬菌体文库进行了“化学交联筛选”，以鉴定那些可以与抗原共价结合的噬菌体（图1B）。经过两轮“化学交联筛选”后，作者将出现频率高的scFv氨基酸序列的克隆被包装为单克隆噬菌体（命名为CL-E2）（图1C）。当E64AcrK与CL-E2噬菌体在DPBS（pH 8.8）中孵育48h时，使用抗体antiphage-pIII检测E64AcrK 与 pIII-scFv的交联条带（图1D，E）。当CL-E2-mFc在化学交联条件下与E64AcrK孵育时，还观察到对应于共价交联抗原-抗体复合物的条带（图1F）。作为对照，CL-E2或CL-E2-mFc在相同条件下不与WT hIL-1β交联（图1F）。此外，将AcrK掺入hIL-15β的另一个位点（Q15）中以产生Q15AcrK，也没有与CL-E2-mFc交联（图1F）。这些结果表明，这种抗体-抗原交联反应是抗体-表位正交的。由于靶表位上掺入的AcrK的化学交联活性，CL-E2很可能是在体内克隆选择和进化的，然后通过设计的噬菌体筛选方法富集和鉴定。 图1. AcrK加入hIL-1β可诱导具有交联活性的抗体
为了进一步评估化学交联活性在表位定向抗体反应中的贡献，作者测试了与AcrK相比化学交联活性较弱的另一种赖氨酸类似物Kcr是否也可以将抗体反应定向到特定表位。构建、表达和纯化了hIL-1βE64Kcr，并进行了与AcrK突变体相同的小鼠免疫和噬菌体文库构建。接下来，为了评估hIL-1βE64Kcr免疫噬菌体库中与靶表位结合的抗体丰度，对hIL-1βE64Kcr进行了常规筛选。经过两轮实验，对96个样品进行了测序和分析，产生84个含有全长小鼠scFv的克隆，这些克隆可以根据同源性分为五个簇，每个簇（簇 I, E64Kcr-A5/E10; 簇 II, E64 Kcr-G9/C9; 簇 III, E64 Kcr-A4; 簇 IV, E64 Kcr-B9; 簇 V, E64 Kcr-H11）中挑选出代表性的包装为单克隆噬菌体。ELISA实验表明，与hIL-1βE64Kcr相比，E64Kcr-A5/E10（簇I）和E64Kcr-G9/C9（簇II）与hIL-1β63−66A的结合亲和力显著降低（图2A），表明这两组抗体可能与hIL-1β的E64表位结合。E64Kcr-A4（簇III）、E64Kcr-B9（簇IV）和E64Kcr-H11（簇V）在hIL-1βE64Kcr和63−66A之间没有显著的亲和力差异，这表明这些噬菌体结合到该表位可能不是通过与63−66残基侧链的直接相互作用（图2）。然而，这并不一定排除它们可能与附近的表位结合的可能性。基于这种分析，与靶表位结合的单克隆噬菌体占84个分析噬菌体中的近一半（图2B）。接下来，作者表达并纯化了E64Kcr-A5-mFc、E64KcrG9-mFc、E64Kcr-A4-mFc、E64Kcr-H11-mFc和E64Kcr-B9-mFc，以进一步验证它们在蛋白水平上的结合表位。图2C表明，hIL1b的6-7A、40-41A和63-66A残基是E64Kcr-A5-mFc与E64Kcr-G9-mFc结合的“热点”。40-41A突变对结合亲和力的不利影响最大。五种抗体与Canakinumab的竞争ELISA实验表明，Canakinumab能够与E64Kcr-G9-mFc和E64Kcr-A5-mFc竞争结合hIL-1β（图2D）。
图2. Kcr加入IL1β诱导表位定向抗体反应
为了了解hIL-1βE64Kcr诱导的表位特异性抗体的富集是否与Kcr的化学反应性有关，作者将E64Kcr-G9-mFc或E64Kcr-A5-mFc与hIL-1βE64Kcr在交联条件下孵育48 h。Western blot分析未见交联产物（见文章补充材料）。然而，这两种抗体与hIL-1βE64AcrK的反应性比hIL-1βE64Kcr更强，将其孵育产生了一个交联复合物。相比之下，这两种抗体没有与对照hIL-1βQ15AcrK交联。这些结果表明，hIL-1βE64Kcr或hIL-1βE64AcrK可以通过位点特异性交联活性来指导体内抗体对目标表位的反应（图3）。
图3. E64Kcr-A5-mFc和E64Kcr-G9-mFc与E64AcrK特异性交联
虽然常规亚单位疫苗的抗体反应可以通过工程结构或与佐剂组合来增强，但中和滴度与总抗体滴度的比值通常较低，并且难以通过现有方法提高。如果靶表位位于与IL1RI的关键结合位点，则由Kcr掺入抗原引发的表位定向抗体的富集将在体内有效地中和IL-1β的功能。根据hIL-1β-IL1RI（ECD）复合物的结构（图4A），Q15、G33、N53 和 I106 位于相互作用界面上，因此选择这些位置分别掺入 Kcr，以提供相应的突变体（Q15Kcr、G33Kcr、N53Kcr 和 I106 Kcr）。根据已发表的方法用这些突变体对小鼠进行免疫。在第三次免疫接种后10天检查血清IgG滴度。用WT hIL-1β免疫的小鼠和突变体都显示出高滴度和相当的滴度（图4B）。接下来，收集小鼠血清，通过protein A 树脂纯化总IgG，并评估每组总IgG的中和作用。HEK-Blue IL-1R是一种工程细胞系，在细胞膜上稳定表达IL1RI，可被IL-1β激活会分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP）。IL-1β的水平可以通过测量细胞培养物中SEAP的量来评估。来自Q15Kcr，G33Kcr，N53Kcr和I106 Kcr免疫小鼠的总IgG显著抑制hIL-1β对HEK-Blue IL-1R细胞的活化，而来自WT和DPBS免疫小鼠的IgG没有抑制作用（图4C）。其中，来自hIL-1βQ15Kcr免疫小鼠的IgG具有最强的抑制作用（图4D）。作为对照，产生K138 Kcr突变体，其中Kcr掺入非IL1RI结合位点残基138（图4A）。来自K138Kcr免疫小鼠的总血清IgG没有抑制hIL-1β对HEK-Blue IL-1R细胞的活化（图4C）。此外，作为第二对照，，pNO2F取代Q15（Q15pNO2F），用这种突变体免疫的小鼠产生的IgG也没有显示出中和活性（图4C，D），即使其总滴度与Kcr突变体相似（图4B）。这些结果证实了先前的观察结果，即pNO2F掺入的TNFα 显示出增强的总抗体滴度，但对掺入的表位没有特异性。
图4. Kcr引入表位诱导的抗体具有hIL-1β的中和作用 图5. Kcr修饰的多肽诱导抗体富集 总的来说，作者将具有交联活性的AcrK和Kcr结合到抗原的特定表位中，免疫小鼠以产生能够与抗原共价交联的抗体。利用抗体克隆选择和体内进化，可以产生正交抗体−抗原交联反应。通过这一机制，开发了一种新的方法，可以在体内轻松地诱导抗体结合到抗原的特定表位上。在用AcrK或Kcr结合的免疫原免疫小鼠后，抗体被定向并富集到蛋白抗原或肽-KLH偶联物上的目标表位。以上效果非常突出，大多数被选择的命中点都与目标表位结合。此外，该表位特异性抗体能有效地阻断IL-1β激活其受体，表明其具有开发蛋白亚单位疫苗的潜力。 文章作者：YJ 原文引用： https://doi.org/10.1021/acscentsci.3c00265 责任编辑：LD
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