本文是一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章，通讯作者丹娜法伯癌症研究院主任Lyn Jones。其主要关注基于化学的癌症治疗靶点识别技术的开发以及药物设计与研发等领域。在本文中，其开发了一种称为HiBiT-SpyTag002/SpyTag-HiBiT的具有24-25个氨基酸的短肽标签，可有效用于dTAG介导的蛋白降解，从而有效应用于内源性蛋白质泛素化降解活性以及降解后的生物学影响，同时在内源性蛋白降解水平检测上用作阳性对照，助力PROTAC降解剂的开发。

靶向蛋白质水解策略现已成为开发新的小分子疗法的一种强有力手段。目前主要通过两种技术实现小分子诱导的蛋白泛素化降解，即分子胶和蛋白水解靶向嵌合体技术（PROTACs）。蛋白水解靶向嵌合体技术是通过对蛋白抑制剂进行化学修饰，改造成PROTAC降解剂，使蛋白经泛素化途径进行降解。其主要优点是在抑制特定蛋白功能或特定蛋白-蛋白相互作用的同时，PROTAC降解剂还可重复使用，再循环以持续诱导目标蛋白的降解。截至目前已经有非常多成功的PROTAC降解剂被开发，但仍有非常多在分子上即使经过非常大的化学上的努力以及全面的表征后仍收效甚微PROTAC降解剂的案例。造成这一现象的主要原因是对目标蛋白靶向降解后造成的生物学效应缺乏良好的早期验证方法，从而难以预测目标蛋白的降解性，以及通过PROTAC降解后的实际效用。因此辅助PROTACs技术的，用于蛋白降解阳性对照的化学工具的开发就变得尤为重要。

蛋白降解标签dTAG是一种研究目标蛋白降解后生物学效应的有效工具，但其缺点在于dTAG降解标签尺寸过大（＞12 kDa），容易影响蛋白自身功能。同时由于插入片段过大，也会导致低的遗传敲入效率。针对这一问题，作者此处开发了一种只有24-25个氨基酸长度的蛋白降解标签，即HiBiT-SpyTag002和SpyTag-HiBiT标签，统称为HiBiT-SpyTag。这一HiBiT-SpyTag标签融合了两段功能序列。HiBiT是11个氨基酸的肽段，其基于分裂荧光素酶方法，可以通过与LgBiT蛋白融合从而重构具有生物学功能的NanoLuc荧光素酶，实现目标蛋白的荧光检测，从而实现蛋白定量。SpyTag是13个氨基酸的短肽，SpyTag002是14个氨基酸的短肽，两者都可以与SpyCatcher蛋白发生共价交联，从而被SpyCatcher蛋白捕获。通过将这一方法与现有的dTAG技术进行融合，使用dTAG-SpyCatcher融合蛋白便可实现对融合表达HiBiT-SpyTag的目标蛋白进行共价捕获并通过泛素化途径进行降解，这一过程亦可以通过HiBiT进行荧光定量表征。是一种多功能的小尺寸蛋白靶向降解技术。

在本文中，作者首先对一种高度可降解的BRD4蛋白使用该技术进行可行性验证，而后针对一种目前已知的癌症靶点，内质网膜蛋白IRE1α，使用该技术进行蛋白降解性以及降解后的生物学影响表征，并根据表征结果进行IRE1α蛋白的PROTAC降解剂开发。

图1. (A)用于N末端标记的HiBiT-SpyTag002标签和用于C末端标记的SpyTag-HiBiT标签的序列; (B)使用CRISPR-Cas9系统对蛋白质进行肽段的内源性标记，表达含有HiBiT-SpyTag蛋白的细胞后可以转染dTAG-SpyCatcher蛋白进行靶蛋白降解; (C)HiBiT-SpyTag标签的双重功能。当HiBiT结合LgBiT后形成功能性荧光素酶从而进行蛋白定量。dTAG-SpyCatcher与SpyTag发生共价结合从而介导蛋白泛素化降解。

HiBiT-SpyTag在BRD4蛋白上的功能性验证。首先，在先前的实验中已经证明了基于分裂荧光素酶方法的HiBiT肽段可与互补的LgBiT蛋白发生融合从而产生功能性的NanoLuc荧光素酶并进行蛋白的定量表征，此外SpyTag序列也被证明可有效的与SpyCatcher蛋白进行共价结合。此处作者假设HiBiT-SpyTag的直接融合不会影响两者自身的功能，从而实现多功能化。同时这里作者对SpyTag进行了优化，改进为具有更优良标记动力学的SpyTag002肽段。基于这一肽段，作者建立了25个氨基酸长度的HiBiT-SpyTag002标签并通过CRISPR-Cas9技术将其融合进HEK293T细胞中BRD4蛋白的N末端。获得融合蛋白后，作者首先进行了荧光活性测试，发现结果呈阳性，表明HiBiT序列正常发挥其功能，可有效形成具有正常生物学功能的NanoLuc荧光素酶，证明荧光定量功能完好。而后进行降解活性表征。在插入HiBiT-SpyTag标签的HEK293T细胞中，使用dTAG-SpyCatcher蛋白进行转染，孵育24小时后使用dTAG蛋白的降解剂dTAG13表征降解活性，同时以一种已知的BRD4蛋白降解剂dBET6作为阳性对照。发现不论dTAG-SpyCatcher是否存在，dBET6都能正常降解BRD4蛋白，而dTAG13只有在进行了dTAG-SpyCatcher转染的细胞中成功实现了降解，这表明SpyTag标签在与HiBiT标签融合后仍具有正常共价结合SpyCatcher蛋白的功能。综上证明了HiBiT-SpyTag融合标签实现蛋白降解-荧光定量多功能化的可行性。

图2. 用dTAG-SpyCatcher降解HiBiT-SpyTag002-BRD4. (A)用BRD4降解剂dBET6处理表达HiBiT-SpyTag002-BRD4蛋白的HET293T细胞后的靶蛋白活性曲线; (B)用dTAG-SpyCatcher转染表达HiBiT-SpyTag002-BRD4蛋白的HEK293T细胞5，24小时以及混合了E3泛素连接酶抑制剂MLN4924后5小时孵育的靶蛋白活性曲线; (C)使用dBET6，dTAGv-1以及dTAG13在是否进行dTAG-SpyCatcher转染条件下的靶蛋白活性曲线。

HiBiT-SpyTag标签用于IRE1α蛋白降解性表征。在通过BRD4实现了HiBiT-SpyTag标签的功能验证后，作者尝试将该方法用于IRE1α的降解中。IRE1α是一种真核细胞中参与未折叠蛋白响应（UPR）的重要酶，UPR的失调与包括癌症在内的多种疾病的发展有关，因此靶向IRE1α是一种潜在的癌症治疗策略。为了更好的开发IRE1α的降解剂，验证IRE1α通过CRL4^CRBN E3泛素连接酶的具有良好降解活性是进行降解剂开发的先决条件。同时考虑到IRE1α的激酶和RNase结构域都位于面向细胞质的C端附近，因此此处作者采用了C端插入的SpyTag-HiBiT标签。通过同样的方法建立HEK293T细胞系，进行dTAG-SpyCatcher转染并进孵育24小时。同时为了确定dTAG-SpyCatcher的细胞标记效率，作者使用基于分裂荧光素酶的WB方法对蛋白进行了表征。发现在未转染的细胞中只出现了IRE1α的条带，而转染后出现了分子量更高的第二条带，这表明dTAG-SpyCatcher成功标记了IRE1α蛋白，通过明度测定表明转染24小时后有70~77%的IRE1α成功实现了标记。而后作者使用与BRD4类似的方法，使用dTAG13进行蛋白降解活性测试。结果表明经24小时孵育，有61~70%的蛋白被降解。这一结果表明IRE1α蛋白具有良好的泛素化降解活性。是进行PROTAC降解剂开发的基础。

图3. IRE1α-SpyTag-HiBiT的降解。(A)使用融合分裂荧光素酶的WB对HiBiT-SpyTag与dTAG-SpyCatcher结合能力进行表征; (B)用dTAG-SpyCatcher对表达IRE1α-SpyTag-HiBiT的HEK293T细胞进行转染，24小时后使用dTAG13进行处理，从而对降解效率进行评估。

IRE1α蛋白降解剂的开发。通过HiBiT-SpyTag对IRE1α经过泛素化途径的降解活性进行表征，确定其具有良好降解活性后作者决定开发一种IRE1α的PROTAC降解剂。其基于的抑制剂底物为RNase抑制剂MKC8866，靶向IRE1α的RNase亚基。主要通过修饰上苯基戊二酰亚胺这一E3连接酶结合剂使其具有PROTAC功能，并将其命名为CPD-2828以及甲基化版本CPD-3121。而后作者通过Rosetta分子对接软件进行了这一分子与CRBN和IRE1α三元复合物相互作用方式的理论计算，确定其理论上具有良好而结合能力。

图4. (A)基于MKC8866及其类似物4μ8C的IRE1α的PROTAC降解剂分子设计; (B)基于Rosetta的 CPD-2828，CRBN以及IRE1α三元复合物结合模式的理论计算模型

进行理论计算后，作者使用IRE1α-SpyTag-HiBiT降解测试来评估CPD-2828的PROTAC降解活性。结果表明在CPD-2828孵育24小时后，CPD-2828的降解效率为65±2%，IC50值为1.3 μM。同时有趣的是，使用MKC8866处理的细胞中IRE1α-SpyTag-HiBiT的表达量呈剂量依赖性增加，这表明MKC8866的抑制可能导致了IRE1α-SpyTag-HiBiT的负反馈表达。而甲基化的CPD-3121没有表现出对IRE1α的抑制能力。接下来作者通过定量蛋白质组学评估了IRE1α降解物的选择性。通过使用10μM的CPD-2828对细胞孵育5小时，观察到与DMSO对照组相比IRE1α水平明显下调，进一步证明了CPD-2828的降解活性。表明这一PROTAC降解剂对IRE1α具有良好的降解功能。

图5. 用IRE1α PROTAC抑制剂进行降解活性测试。(A)用CPD-2828，MKC8866以及CPD-3121进行24小时孵育后HEK293T细胞中IRE1α相对丰度; (B)CPD-2828，CPD-3121，Len以及CC-220进行NanoBRET CRBN结合测试的标准化NanoBRET信号强度曲线; （C）使用10 μM的CPD-2828和DMSO对照组对HEK293T细胞孵育24小时后的定量蛋白质组学分析。

总之，本文中作者开发了一种只有24-25个氨基酸大小的短肽蛋白质降解标签。其融合了可通过分裂荧光素酶进行蛋白定量表征的HiBiT序列和基于dTAG方法进行蛋白降解的SpyTag序列实现了降解标签多功能化。这一降解标签可用于验证内源性蛋白的降解活性以及降解后生物学影响的表征。通过这一方法可以有效验证目标蛋白是否是进行PROTAC降解的良好靶点，从而辅助PROTAC降解剂的开发。基于这一技术，作者此处也成功验证了IRE1α的泛素化降解活性，并开发出了具有良好PROTAC功能的小分子降解剂CPD-2828，进一步验证了该方法的实用性与可行性。

文章作者：QJL

原文引用：10.1021/acschembio.3c00084

责任编辑：LD