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给大家推荐一篇发表在Cell Metabolism上的文章，文章标题是Organelle-selective click labeling coupled with flow cytometry allows pooled CRISPR screening of genes involved in phosphatidylcholine metabolism。其通讯作者是京都大学的Itaru Hamachi教授。课题组主要工作包括蛋白质工程、蛋白质可视化和神经化学生物学等方面。
磷脂酰胆碱（PC）是哺乳动物膜中最丰富的磷脂，其代谢异常与多种疾病有关。目前对PC调控的研究主要通过营养缺陷型酵母的筛选，但该方法难以发现非致死的PC调控基因。作者开发了一种策略，将细胞器选择性点击标记与基于流式细胞术的CRISPR筛选技术相结合，将细胞器PC的表型转为荧光信号，称为细胞器选择性点击化学与流式细胞术——O-ClickFC。 O-ClickFC包括三个步骤，如图1所示。首先，叠氮胆碱（N3-Cho）通过内源途径代谢标记PC，然后使用细胞器靶向的可点击染料（OCD）进行荧光标记，最后通过流式细胞术（FACS）进行测量。
图1. O-ClickFC的分析工作流程。
在基于FACS的定量分析中，O-ClickFC需要具有高动态范围的标记信号和不会重叠波长的OCD组合。作者对九种具有不同光谱特性的可点击染料进行了筛选，并通过共聚焦显微镜成像进行分析。如图2A所示，疏水性的BODIPY衍生物——BDP和8AB，选择性地定位于ER/Golgi，AF647能够可视化质膜外叶（OPM）中的PC，Cy3则可以选择性地标记线粒体PC。FACS结果也显示，N3-Cho处理过的细胞，其荧光强度高于未处理过的细胞（图2B）。 接下来，作者研究了这种方法是否可以揭示与PC生物合成的遗传扰动相关的亚细胞表型。CDP-胆碱途径是哺乳动物PC生物合成的主要途径，而磷酸胆碱胞苷转移酶（CCT）是该过程的限速酶。作者用编码CCTα（CCT的主要亚型）的PCYT1A的sgRNA转导了大量表达Cas9的K562细胞。在对ER和Golgi选择性标记后，流式结果可以看到细胞分成两个群，如图2C所示。对线粒体和OPM进行了相同的实验，也显示PCYT1A-KO细胞的荧光强度降低（图2D），证明了O-ClickFC检测PC合成缺陷基因型与表型相关性的可行性。 同时，为了研究这种方法是否可以用于研究PC转运缺陷，作者在细胞与N3-Cho孵育5小时后加入了BFA，一种可以抑制ER到质膜运输的抑制剂。结果发现，ER、Golgi和线粒体的荧光强度在BFA处理后没有显着变化，而OPM的荧光信号下降了约70%（图2E），与PC转运受到抑制的表型一致。 总而言之，O-ClickFC可以根据每个细胞器的荧光强度差异来识别在PC合成和运输方面表现出缺陷的细胞。
图2. 流式细胞术测量PC在细胞器水平上的丰度。
在确认了O-ClickFC方法的可行性后，作者将其应用于全基因组CRISPR-KO筛选，以鉴定与PC生物合成相关的基因。如图3A-B所示，将表达Cas9的K562细胞用GeCKOv2文库和Brunello文库转导，然后用BDP-DBCO标记，将荧光强度最暗的1%的细胞通过FACS收集并进行NGS分析。筛选结果如图3C所示，成功鉴定到了上述的PCYT1A，以及两个与脂肪酸合成相关的基因，ACACA（乙酰辅酶A羧化酶1）和SLC25A1（柠檬酸转运蛋白），表明O-ClickFC可以识别参与PC合成的基因。
图3. 基于O-ClickFC的CRISPR-KO筛选，以鉴定参与PC生物合成的基因。
接下来，在筛选到的基因中，作者对未知其是否参与PC合成的基因进行了研究。在细胞周期中，CCTα的活性因其C端发生磷酸化而下调，而CHEK1（编码检查点激酶1，CHK1）通过CDK2途径控制细胞周期，作者认为其可能控制CCTα活性。如图4A所示，PC标记强度会被CHK1抑制剂（CHK1i）降低，但可以被CDK2抑制剂（CDK2i）恢复。 为了研究抑制CHK1对体内PC代谢的影响，作者在小鼠体系应用O-ClickFC技术。流式结果显示，CHK1i降低了小鼠白细胞中的PC标记水平。于是，作者研究了CHK1-CDC25A-CDK2途径是否调节CCTα的磷酸化状态。通过磷酸标签电泳，作者发现，在用正常含胆碱培养基培养的细胞中，CCTα以高度磷酸化的非活性形式存在，在无胆碱培养基中，CCTα以去磷酸化活性形式存在（图4C，泳道1和2）。在CHK1i处理后，无胆碱培养基中的CCTα磷酸化水平显着增加（图4C，泳道2和3），并且几乎与在含胆碱培养基中观察到的非活性状态相同（图4C，泳道1和3）。相比之下，CDK2i与CHK1i的结合减少了过度磷酸化的带A，并增加了磷酸化程度较低的条带B和C（图4C，泳道3和4）。这些结果表明，CHK1-CDC25A-CDK2途径通过调节CCTα的C端丝氨酸残基的磷酸化状态来调节CCTα的酶活性（图4D）。 随后，作者分析了FLVCR1，其缺乏会强烈降低各种细胞系中的PC标记。作者使用胆碱氧化酶介导的偶联酶测定法定量了从细胞质中提取的天然胆碱，FLVCR1-KO细胞中内源性胆碱的量减少了近80%（图4E），其较低的PC标记又可以通过FLVCR1的过表达而恢复（图4F）。另外，作者构建了疾病相关FLVCR1突变的细胞，结果发现，两种疾病相关的突变体C192R和A241T完全缺乏胆碱转运能力（图4H）。
图4. CHEK1和FLVCR1在PC合成中的作用。
最后，作者使用O-ClickFC鉴定与亚细胞PC分布相关的基因。作者在Brunello文库转导的K562细胞中使用BDP-DBCO和AF405-DBCO，双色流式细胞术显示OPM中标记强度降低，但在ER-Glogi中保持标记，表明PC转运到OPM受损（图5A-B）。将与细胞内转运相关的基因富集，并从前100名中选择了28个已知或未知参与膜转运的基因，进一步筛选得到了8个与囊泡转运和脂质转移相关的基因（图5C）。 由于CDC50A的sgRNA导致OPM标记强度最低，作者进一步研究了该基因。通过甲基-α-环糊精选择性地提取OPM中的磷脂，LC-MS显示CDC50A-KO细胞的OPM部分的内源性PC显着降低（图5E），表明CDC50A-KO下调细胞表面PC含量，与磷脂双分子层中不对称的PC有关。 采取同样的手段，对线粒体PC转运相关基因进行了筛选，如图5G所示。与上述结果类似，确定了STARD7是线粒体PC转运的主要因素（图5H-I）。
图5. 基于O-ClickFC的CRISPR-KO分析PC的亚细胞转运。
总的来说，作者将细胞器点击标记与流式细胞术相结合，开发了O-ClickFC技术，以鉴定参与PC代谢的人类基因。该技术可以通过FACS以亚细胞分辨率直接测量PC的丰度，从而可以对亚细胞水平PC分布进行高通量CRISPR筛选。 文章作者：CXY DOI：10.1016/j.cmet.2023.02.014 责任编辑：LD
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