推荐一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，文章标题是Bioorthogonal Lanthanide Molecular Probes for Near-Infrared Fluorescence and Mass Spectrometry Imaging。其通讯作者是北京大学的陈兴教授、张俊龙教授和中科院化学所的赵耀副研究员。陈兴课题组的研究集中于化学糖生物学和生物纳米技术；张俊龙课题组专注于活细胞内重要分子事件检测的发光金属配合物探针的开发；赵耀课题组致力于多靶点金属抗肿瘤药物的研究。在本文中，作者开发了一种用于生物分子的生物正交标记的可点击和高效近红外(NIR) 荧光镧系元素(Ln)配合物。

荧光显微镜可以选择性地对生物过程进行高时间和空间分辨率的检测，开发具有特定光物理特性的新型荧光探针有广阔的前景。近红外荧光团具有深层组织穿透、低光子散射和可忽略的自发荧光的特点，但目前可用的NIR荧光团通常存在生物相容性差、化学和光稳定性不足和量子产率低的问题。因此，开发具有高亮度和稳定性的近红外荧光团具有重要意义，作者将叠氮基和炔基等生物正交官能团安装到镧系元素配合物上，通过点击化学与目标生物分子结合。

首先，作者合成了三种具有不同镧系元素的NIR Ln配合物（Ln=Yb³⁺、Nd³⁺或Er³⁺），但这些NIR Ln配合物的水溶性较差，使它们难以运用于生物系统。为了增加探针的亲水性，将这些镧系元素配合物分散在水溶性磷脂胶束中。在532 nm下激发水中Yb-1、Nd-1和Er-的磷脂胶束，Yb-1表现出最强的近红外荧光。因此，作者基于Yb复合物来开发可点击的NIR Ln复合物。引入了带正电荷的铵基团以增强水溶性，同时在中间位置引入炔基或叠氮基以避免干扰Yb配合物的光物理特性。Yb-2包含一个炔基，而Yb-3和Yb-4分别包含四个炔基和叠氮基，三者表现出相似的紫外/可见吸收光谱。

随后，作者评估了三种Yb探针的水溶性。结果发现，与DMSO中的荧光相比，在PBS中观察到Yb-3和Yb-4的荧光强度降低了14倍，这表明水严重猝灭了Yb-3和Yb-4的NIR发光。相比之下，亲脂性的Yb-2在水中所收到的影响更小。作者提出了一种假设，水的O-H键振动可以有效地淬灭亲水性Yb-3和Yb-4中的NIR发射，而疏水性Yb-2倾向于在水中聚集，从而防止荧光被水猝灭。但是，Yb-3和Yb-4的荧光强度在与各种代谢前体结合后增加了约3到4倍，而且表现出了良好的pH稳定性、光稳定性和低细胞毒性，使它们成为生命系统中生物正交标记的更为理想的选择。

图1. Yb-1/Nd-1/Er-1和水溶性可点击复合物Yb-2/-3/-4的合成路线

图2. Yb-1、Nd-1、Er-1的光谱信息。

为了评估可点击的Yb³⁺复合物对生物正交标记的适用性，作者在水中测试了Yb-2、Yb-3和Yb-4与各种非天然代谢前体的缀合。高分辨率质谱证实了相应Yb-3和Yb-4共轭物的形成，但没有Yb-2共轭物，Yb-2的聚集可能会阻碍点击反应。随后，作者用一系列非天然类似物（AHA、GalNAz、SiaNAz、EdU和EU）对细胞进行代谢标记，并用Yb-3和Yb-4进行点击连接来进行检测。结果显示，近红外荧光标记与先前报道的荧光探针一致。

图3. 通过生物正交化学代谢标记一系列生物分子

为了避免在活细胞中点击标记过程中可能出现的铜毒性，作者基于SPAAC反应进行NIRF成像以评估Yb-4的效果。通过DBCO-Sulfo-NHS酯共价标记HeLa细胞的表面蛋白，然后Yb-4进行SPAAC反应。结果显示，在细胞表面观察到Yb-4的强NIR荧光，表明Yb-4成功标记了膜蛋白。另外，作者还通过DBCO功能化的链霉亲和素实现了免疫荧光成像，对细胞中的α-微管蛋白实现了NIRF成像。

图4. 基于SPAAC实现Yb-4点击标记细胞膜蛋白

NIR荧光团的一大优势就是能够与可见光区域的荧光团结合进行多色成像，作者将Yb-3和Yb-4的点击标记与免疫荧光染色相结合。在经SiaNAz处理的COS-7细胞中，细胞表面的唾液酸聚糖被Yb-3点击标记，再结合Histone H3蛋白免疫染色、MitoTracker Orange染色和Hoechst33342染色，在同一细胞的细胞膜、细胞核、线粒体和DNA上清晰地观察到强烈且定位正确的荧光信号，表明可点击的Yb³⁺探针可以与各种荧光染色和标记程序结合，用于不同细胞靶标的成像。

图5. 不同细胞靶标的多色NIR成像。

图6. HeLa细胞中SiaNAz标记的唾液酸糖蛋白的click-ExM成像

二次离子质谱(SIMS)是一种高分辨率表面分析技术，包括NanoSIMS和ToF-SIMS。镧系元素与抗体结合，可以用于肿瘤切片中多种生物标志物的NanoSIMS成像。相比之下，ToF-SIMS可以检测宽m/z范围内的所有离子，使其可以运用于原位细胞成像。作者将HeLa细胞用AHA进行代谢标记，再点击标记Yb-3，冻干后用于ToF-SIMS成像，在ToF-SIMS中检测到了[YbF₄]^-特征信号，其成像结果与NIR成像结果一致。与Yb-3类似，通过点击Yb-4标记，DNA和RNA的ToF-SIMS成像也在EdU或EU标记的HeLa细胞中实现。

图7. HeLa细胞（左）及其相应的阴性对照（右）中各种代谢标记的生物大分子的ToF-SIMS图像

ToF-SIMS成像可用于对标记的生物分子进行成像，但难以区分确切的亚细胞定位。通过ToF-SIMS与荧光成像的相关性，将Hela细胞接种在可寻址的共聚焦培养皿上，与EdU一起孵育并点击标记上Yb-4，然后将细胞冻干用于DNA的NIRF和ToF-SIMS成像。结果显示，可以观察到DNA的强NIR荧光信号，且与Hoechst 33342标记的细胞核具有良好的共定位。接着进行ToF-SIMS成像，将NIRF图像和ToF-SIMS图像对齐合并，[YbF₄]^-信号几乎与NIRF和Hoechst通道共定位，首次实现了NIRF和ToF-SIMS的双重成像。

图8. 在EdU代谢标记的HeLa细胞中使用Yb-4对DNA进行NIRF-ToF-SIMS双重成像

文章作者：CXY

DOI：10.1002/anie.202208707

责任编辑：LD