分享一篇发表在Cell Chemical Biology上的文章“An N terminomics toolbox combining 2-pyridinecarboxaldehyde probes and click chemistry for profiling protease specificity”，本文的通讯作者是来自威斯康星大学麦迪逊分校的Amy M. Weeks教授，研究方向是蛋白翻译后修饰的空间分布、蛋白质工程以及化学蛋白组学。在这篇文章中，作者在组学层面上对N端标记试剂2-吡啶甲醛（2PCA）进行了评价，并发展了用于研究蛋白酶底物的组学方法。
N端标记技术可以实现对蛋白酶水解事件的组学解析。尽管目前的N端标记技术已经取得了一定的进展，但受到序列特异性高、效率低等方面的限制。2PCA作为一种N端反应试剂，可以首先与多肽的N端反应生成亚胺，而后与邻近肽骨架酰胺键中的氨基反应形成咪唑烷酮，而侧链Lys中的氨基由于缺乏邻近的氨基而无法与2PCA反应形成稳定的产物。因此，在这篇文章中，作者以2PCA为基础结合化学蛋白组学技术，开发了N端标记组学策略（CHOPPER）用于蛋白酶底物的研究。
首先，作者评价了2PCA的标记效率，他们发现在由trypsin、GluC和chemotrypsin切割构建的多肽库中，2PCA的加入均能产生89.0265Da的质量偏移且具有较好的N端特异性。此外，作者也进一步评价2PCA的修饰是否受到位置协同作用的影响，他们发现当末端氨基酸为Gly时2PCA对临近氨基酸为Gly/Ala的肽段具有更高的偏好性，而其余则并未表现出明显的序列偏好性。随后，作者也将2PCA用于了蛋白酶切割位点的检测，在“catch-and-release”策略中，蛋白质组中首先加入反应试剂屏蔽N端，而后加入蛋白酶进行水解，随后再对新生成的N端进行富集和检测。与此前的方法相比，作者发现与传统的二甲基化策略相比，2PCA能够更好的反应蛋白酶的切割位点。
随后，作者发展了N端标记组学策略CHOPPER用于研究细胞凋亡中caspase的水解底物。由于在细胞凋亡中，caspase家族蛋白的主要功能是切割天冬氨酸的C端（P1=D），因此N端组学在这种细胞程序性死亡中受到了广泛的关注。在CHOPPER中，作者在诱导细胞凋亡后采用alkyne-2PCA对所有的N端进行富集，并与未诱导凋亡的对照组进行比较。结果表明在依托泊苷诱导后2PCA富集到了更多P1=D的肽段（229/1587），生物信息学分析也表明，新发现的切割事件（红色圆点）主要富集在已知受caspase影响的信号通路中，这些底物蛋白主要参与调解蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA相互作用以及蛋白-RNA相互作用，表明凋亡中的蛋白水解主要干扰了蛋白复合物的完整性。总的来说，这篇文章以N端反应试剂2PCA为基础开发了N端富集策略，并实现了对蛋白酶切割事件的研究。
本文作者：WYQ
责任编辑：WFZ
原文链接：
https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(23)00328-8#%20
文章引用：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2023.09.009
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