给大家推荐一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，文章标题是Fluorescence Lifetime Imaging of pH along the Secretory Pathway。其通讯作者是荷兰格罗宁根大学分子免疫学系的Geert van den Bogaart教授。Geert van den Bogaart教授旨在了解并最终定制免疫细胞中的膜运输途径，关注导致外来抗原摄入和降解的细胞过程，以及导致树突状细胞呈递和细胞因子释放的运输级联反应。在本文中，作者应用荧光寿命成像显微镜 (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) 仅用单个激发波长测量细胞器内pH值，实验首先测定沿分泌途径的多种细胞器的pH，之后分析了添加Bafilomycin A1或Brefeldin A后细胞内pH动态变化，最终，作者跟踪了肿瘤坏死因子α从内质网到高尔基体到细胞膜过程中的pH变化。

细胞器内pH反映了分泌途径，内质网 (ER) 的pH大约为7，高尔基体pH从顺面的6.7过渡到反面的6.0。在分泌囊泡释放到细胞外前，pH大约为5.2。pH不仅可以通过影响氨基酸侧链电荷影响蛋白质折叠和酶活性，同时对分泌蛋白运输十分重要。pH会影响分子与运输伴侣的结合亲和力。此外，糖基转移酶及其底物的定位由pH决定，pH稳态失衡会导致各种的人类疾病。因此，沿分泌途径准确确定细胞内pH对于研究和诊断都具有重要意义。

测定细胞内pH的荧光染料已经商用，但其无法实现细胞器特异性。而绿色荧光蛋白(GFP) 的pH敏感型突变，如pHLuorin可以通过融合蛋白标记特定细胞器，从而实现细胞器特异性检测。通过突变产生两类pHLuorin：ecliptic pHLuorin (pH小于6时在475 nm的激发效率下降) 和ratiometric pHLuorin (pH在5.5与7.5之间475/395 nm的激发比逐渐增加)。使用ecliptic pHLuorin，细胞器内pH可以通过475 nm激发的荧光强度与标准曲线对应得到，但其结果不准确，因为荧光强度不仅取决于pH，还取决于pHLuorin的浓度。对于ratiometric pHLuorin，需要分别记录395 nm和475 nm激发谱图计算荧光强度比得到pH值。新发展的ratiometric pHLuorin2荧光信号提高了8倍。而比例型成像也有背景荧光敏感性导致比值变化、需要两种不同激发波长进行两次谱图采集等缺点。由于细胞高度动态，两次激发可能导致发射信号错位，从而影响比值计算。

文献利用荧光寿命对激光强度和pHLuorin浓度不敏感而对pH敏感这一内在特性，发展了荧光寿命成像显微镜 (FLIM) 用于细胞器pH高时空分辨率的准确检测。

首先，用FLIM研究ratiometric pHLuorin2的荧光寿命和pH的关系。在不同pH条件下，pHLuorin2的发色团中的对羟基亚苄基-咪唑环酮部分，可以以中性苯酚或阴离子苯酚盐形式存在。实验在不同pH溶液中用488 nm激发对重组RpHLuorin2进行了FLIM (图1)。对于GFP，阴离子苯酚盐 (phenolate) 的荧光寿命在2-3 ns内，而苯酚形式的荧光寿命小于100 ps。在488 nm激发时，主要激发苯酚形式的RpHLuorin2，但由于荧光串扰也会有一些苯酚盐形式的RpHLuorin2。因此，观测到的荧光寿命可以被视为中性和阴离子形式的混合物。对于纯化的重组pHLuorin2，实验观测到荧光寿命是依赖于pH的函数，并且荧光寿命随着pH值的增加而增加 (图1a)。而相比于405/470 nm激发的荧光信号比值 (pH响应范围5.5-7.5) 检测方法，荧光寿命在较大的pH范围内发生了变化 (4.5-7.5;图1d)。这种较大的动态范围可能是由第二次质子化事件引起的，增加了可以确定的pH值的范围，是FLIM的一个优点。

图1 重组RpHLuorin2的FLIM

之后，利用FLIM在分泌途径中检测pH。为了准确测定特定细胞器的pH值，作者将RpHLuorin2融合到位于分泌途径中特定亚细胞位置的蛋白质上。为了测定整个分泌途径涉及细胞器的腔内pH，作者将RpHLuorin2融合到ER驻留蛋白钙网蛋白的信号序列、用于ER靶向的C端ER保留信号KDEL、高尔基体顺面/中间膜囊蛋白MGAT2、高尔基体反面膜囊GalT、高尔基体反面膜囊TGN46、溶酶体相关膜糖蛋白1 (LAMP1)、质膜 (即细胞外) GPI (图3a)。对于高尔基体的酶 (MGAT2, GalT)，作者去除了催化位点，只保留负责定位的跨膜区域和茎区域。之后，在HeLa细胞中表达构建体并记录FLIM图像。实验使用GPI融合RpHLuorin2 (GPI-RpHLuorin2) 作细胞中表达探针的标准曲线 (图2)，使用与校准纯化的RpHLuorin2相同的pH缓冲液。

图2 在表达GPI-RpHLuorin2的Hela细胞中用FLIM作标准曲线

在完成标准曲线后，实验沿分泌途径在细胞器的腔内进行pH测定 (图3b, c)。使用ER-RpHLuorin2，测得表观平均pH值7.2 [95%置信区间 (CI) ±0.08]；使用MGAT2-RpHLuorin2标记高尔基体中间膜囊，测得表观平均pH值为6.1 (95%CI ±0.07)，使用GalT-RpHLuorin2标记高尔基体反面膜囊，表观平均pH为5.9 (95%CI ±0.07)。最后，对于溶酶体标志物LAMP1-RpHLuorin2，测得表观平均pH为4.7 (95%CI ±0.15)。这些pH值都与文献报道一致。将FLIM的测量结果与比例型测量结果进行比较。对于MGAT2和GalT，比例型测定结果与FLIM有相似的pH值，而比例型方法需要分析大约2倍以上的细胞才能达到类似的95%CI。

图3 基于FLIM的分泌途径标志物的稳态pH测定

为了进一步表征RpHLuorin2 FLIM系统，作者用V-ATPase的抑制剂Bafilomycin A1 (BafA1)培养细胞。V-ATPase是一种蛋白质泵，通过在膜上转运质子来酸化细胞器内腔。实验使用MGAT2和GalT探针，结果表明用200 nM BafA1培养细胞1 h导致高尔基体酸化减少，与没有BafA1相比pH值的降低较少 (图4)。结果表明，RpHLuorin2 FLIM系统适合仅通过单张图像采集进行细胞内pH测量。

图4 通过Bafilomycin A1 不完全封闭高尔基体的酸化

接下来用FLIM测定pH的动态变化。首先在Brefeldin A (BFA) 存在下测定高尔基体顺面膜囊标记物MGAT2-pHLuorin2的pH。BFA是ER-高尔基体运输的有效抑制剂，导致高尔基体驻留酶重新定位到ER上。实验测得在BFA条件下细胞中表观平均pH值为7.1 (95%CI ±0.07)，而在对照中表观平均pH值为6.4 (95%CI ±0.08) (图5a, b)。这一结果表明该系统可以测定活细胞中pH值的动态变化。

接下来，用FLIM实时监测沿分泌途径的pH变化。作者选择肿瘤坏死因子α (TNF-α) 作为通过分泌途径运输的模型蛋白，KDEL作为ER的目标序列，TNFα-SBP-RpHLuorin2融合蛋白 (RUSH TNFα-SBP-RpHLuorin2) 作为报告构建体，从而跟踪TNF-α从ER到高尔基体到达质膜的动态过程。在细胞培养基中不添加生物素时，TNFα-SBP-RpHLuorin2报告构建体都被困在ER中，测得的表观平均pH值为7.58 (95%CI ±0.46)。向细胞中加入生物素后的25 min，TNFα-SBP-RpHLuorin2通过高尔基体，表观平均pH逐渐降至6左右。之后，随着更多的TNFα-SBP-RpHLuorin2到达质膜，pH值逐渐增加 (图5c-e)。该结果表明，基于FLIM的细胞器pH测定具有高时间分辨率。

图5 沿分泌途径的动态pH测定

综上所述，本文提供了基于FLIM测定细胞内细胞器pH的方法。由于具有高时间分辨率，它不仅可以测定静态细胞器中的pH，还可以测量蛋白质沿分泌途径运输过程中经历的动态pH变化。

文章作者：LYJ

DOI：10.1021/acschembio.1c00907

责任编辑：LD