JACS | 利用可去除的O-连接β-N-乙酰氨基葡萄糖胺策略化学全合成正确折叠的富二硫键蛋白质

  • 117
  • A+

介绍一篇JACS上的文献，标题是Total Chemical Synthesis of Correctly Folded Disulfide-Rich Proteins Using a Removable O‑Linked β‑N‑Acetylglucosamine Strategy，通讯作者是清华大学的刘磊教授与中科大第一附属医院的郑基深教授。刘磊教授的研究方向为：1. 蛋白质的化学合成与生物医学应用；2. 生物活性小分子的催化合成及应用。郑基深教授的研究方向为：蛋白质合成生物学，发展蛋白质功能进化的化学/生物交叉新技术，发现多肽和蛋白类药物分子，开发基于镜像生物大分子的信息编码与生物医用材料，用于生物学、药学、生物医学研究。

1


富二硫键蛋白质如胰岛素、白细胞介素等在生物医学、结构生物学以及药学等领域具有重要作用。近年来，随着固相多肽合成技术、多肽连接技术和蛋白质折叠策略的发展，一系列含二硫键的蛋白质得以合成，并极大加速了与之相关的生物医学研究。然而，部分蛋白质，例如全身铁稳态调节激素——铁调素（hepcidin），由于其体外折叠效率低，合成的难度很大。另一类如白细胞介素-5（IL-5），具有很大的分子量，完全无法在体外成功折叠。

作者查阅了富二硫键蛋白在细胞内折叠的过程的报道，他们注意到，一个从核糖体合成的全新蛋白，在被送到内质网与高尔基体加工的过程中，会被糖基转移酶修饰，在其Ser或Thr位点接上糖。这种糖基化修饰被认为是通过提升折叠中间体的稳定性来辅助蛋白质正确折叠。作者因此受到启发，并设计了一种通过引入可去除的糖基化修饰（Removable Glycosylation Modification，RGM）辅助化学合成的富二硫键蛋白质体外正确折叠的方法。

2

Scheme 1. RGM辅助化学合成富二硫键蛋白质体外正确折叠


作者先从铁调素入手。铁调素有25个氨基酸残基，包含4个二硫键，化学合成的铁调素需要通过4次反应使之正确形成二硫键，此过程费时费力。作者使用RGM辅助策略，在铁调素的固相合成阶段使用Fmoc-L-Ser(β-D-GlcNAc(Ac)3)-OH原料，将Ser17替换为糖基化修饰的氨基酸残基，合成获得修饰后的多肽1（产率8%），并通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和电喷雾离子化质谱（ESI-MS）表征。作为对照，作者同时合成了无修饰的天然多肽2（产率9%）。1和2在10 μM (4 M Gn·HCl, 2 mM EDTA, 10 mM GSH, 1 mM GSSG，pH 7.9)缓冲液中折叠，色谱检测显示1在此条件下产生了新化合物3（Fig 1）,质谱检测发现3比1的质量减少8.0 Da，正好对应4个二硫键形成。同时，2与对应化合物2’的质量只相差2.0 Da，并且12 h后，2’的质谱峰完全消失且没有新峰出现，说明在此条件下2发生了错误折叠。

3

Fig 1. RGM策略指导下的铁调素化学合成


为了去除3的O-GlcNAc修饰，作者使用商业化的O-乙酰氨基葡萄糖苷酶（OGA）处理3，使3转变成单一产物4（产率55%），质谱显示4比3减少了203.52 Da，对应了GlcNAc的去除，从1到4的总产率大约是31%，这比先前报道的氧化折叠方法的产率高出很多。除Ser17外，Thr2和Thr25的糖基化也能起到类似效果。作者使用Fmoc-L-Thr(β-D-GlcNAc(Ac)3)-OH原料，分别合成了对应的糖基化修饰产物5和6（产率均为8%），并在相同的条件下让这两个肽折叠形成7和8，去除糖基后都获得了正确折叠的产物4，相比Ser17修饰，Thr2和Thr25修饰后4的整体产率有所下降，分别为27%和25%。

通过二维核磁谱（DQF-COSY，TOCSY和NOESY等），作者对终产物4的二硫键进行了表征，最终确定Cys7−Cys23，Cys10−Cys13，Cys11−Cys19和Cys14−Cys22四个二硫键的正确形成。

在完成铁调素的合成后，作者把目光聚焦到IL-5上。 IL-5是一个26 kDa的同源二聚体，每个单体有115个氨基酸残基，两条链通过2个二硫键连接，目前尚未有体外成功折叠IL-5的报道。

作者将IL-5分成3个部分：IL-5(1−43,T14O‑GlcNAc,T23O‑GlcNAc)−NHNH2 (11，产率7%)， IL-5(44−85,T54O‑GlcNAc,S73O‑GlcNAc)−NHNH2 (12，产率6%)以及IL-5h(86−115) (13，产率13%)（Fig 2）。肽段11和12的合成如前所述，把对应位点的底物换成Fmoc-L-Ser/Thr(β-D-GlcNAc(Ac)3)-OH，藉由固相合成方法获得。11和12的C端是酰肼化的，通过基于酰肼的自然化学连接（NCL），可得到11-12-13的连接产物15（产率26%）。同时，作者也合成了11与12的对应无糖基化肽11’和12’，合成连接产物9。11’和12’的溶解性很差，作者不得不将反应温度提高到60℃以实现两者的连接，这也显示了糖基化在提升多肽溶解度和反应性方面的作用。

4

Fig 2. RGM策略指导下的白细胞介素-5化学合成


单体15的折叠通过梯度透析法实现。将15溶解在变性缓冲液（(150 μM, 6 M Gn·HCl, 100 mM Tris, 1 mM GSH, 100 μM GSSG, pH 7.4）中，离心后取上清并将其依次用含3 M、1.5 M和0.75 M Gn HCl的该缓冲液透析，在RP-HPLC的检测下发现二聚体16的出现。通过质谱检测，证实16的质量比15的两倍少4 Da，提示两条链之间二硫键的生成。在相同透析条件下，单体9有对应产物9’，9’比9少2 Da，提示有链内二硫键产生，是错误的折叠形式。为了指明链间二硫键位点的正确与否，作者对二聚体16做了进一步处理，使用胰蛋白酶消化16，质谱检测的结果显示，消化后的产物正好可以对应Cys44−Cys86′, Cys86−Cys44′这一正确形式，且并无其他产物峰出现（Fig 3）。

之后，作者同样用OGA处理了16，通过尺寸排阻色谱，作者分离得到产物10，10的分子量26294.00 Da与IL-5的分子量相当，SDS-PAGE也显示10在26 kDa附近，用胰蛋白酶消化10得到的片段，其分子量也与理论上IL-5消化后的片段大小一致。此外，10的圆二色谱和商业化IL-5的吸收峰相匹配，表面等离子体共振分析发现10与瑞利珠单抗的结合能力也与IL-5的数据接近。

8

Fig 3. IL-5的表征


总之，作者报道了一种基于可去除糖基化的蛋白质体外折叠策略，这种方法向化学合成的蛋白质中Ser/Thr位点引入GlcNAc，以此促进蛋白质二硫键的正确形成，从而折叠成正确的构象，在折叠结束后，可通过商业化的OGA去除侧链修饰的O-GlcNAc，最终获得正确折叠的目的蛋白，这种方法可赋予化学合成产生的富二硫键蛋白质正确的折叠方式，使蛋白质的化学合成技术趋于完备。


文章作者：CZP

原文引用/DOI：10.1021/jacs.1c10091

责任编辑：LD


weinxin
我的微信
关注我了解更多内容

发表评论

目前评论：