分享一篇2023年发表在Acc. Chem. Res.上的文章，题目是“Fluorescent Probes for Lipid Membranes: From the Cell Surface to Organelles”。文章的通讯作者是法国斯特拉斯堡大学的Andrey S. Klymchenko教授。生物膜是活细胞中普遍存在的脂质结构。它们构成细胞质膜（plasma membrane，PM），并划分了大部分细胞器。生物膜的传感和成像揭示了其脂质组织的显著异质性，大部分鞘磷脂和胆固醇存在于PM，它们优先定位于外小叶，并构成了负责大量细胞功能的微结构域。因细胞生物学家和生物物理学家的大量需求，生物膜化学工具的开发成为一个重要的研究方向，尤其是荧光探针。荧光探针具有高灵敏度，而荧光显微镜的发展又促进了这一探针的发展。目前已开发的荧光膜探针种类繁多，这促使他们根据靶向原理、传感特性和光学响应对其进行分类和进一步整理（图1）。在靶向方面，有针对PM和细胞器的探针。目前研究最多的靶标是PM，而细胞器膜，如内质网（ER）、高尔基体、线粒体等，则是新兴的研究方向。生物膜的结构是含有不同内外小叶的脂质双分子层，因此还可以考虑小叶特异性靶向。脂滴（LDs）是一种无膜的脂-蛋白结构，具有核-壳组织结构。生物膜探针的设计原则是基于其与脂质或膜蛋白的相互作用或反应（图1）。为了靶向脂质部分，常见的方法是将荧光染料与天然脂质或合成膜靶向配体结合。此外，还有生物正交化学、与蛋白质标签偶联（如Halo Tag），或非共价受体-配体相互作用等方法。在脂质工具中，以一种基于十二烷基链和两性离子的膜锚为代表（图1），它是在PM上定位不同荧光团的通用方法：3-羟色胺、尼罗红、方酸、花青素、BODIPY等。然后，作者用阴离子磺酸盐取代两性离子基团，合成了具有高效膜染色特性的尼罗红和Prodan衍生物，这些物质可确保对外小叶进行特异性染色。
图1. 膜探针分类的通用方案。
在传感方面，他们确定了具有恒定发射的基本膜标记和用于生物物理和化学传感的探针（图1）。基本膜标记是由对环境不敏感的经典荧光团构建的，专门用于生物膜成像。用于生物物理传感的膜探针是在环境敏感的荧光团的基础上合成的，其发射颜色、荧光强度或荧光寿命等特性会随着环境的极性、粘度等的改变而改变。作者的研究团队对溶剂变色膜探针做出了贡献，该探针可检测局部极性和脂质顺序。其他研究团队开发了用于监测局部粘度的分子转子，以及用于解决脂质有序和膜张力问题的翻转器。化学敏感探针可探测生物膜上的局部化学物质，如质子（pH值）、离子和氧化还原物质，以及生物大分子，如脂类和蛋白质。最后，根据响应谱对膜探针进行分类。荧光探针会发出荧光，可与传统显微镜技术配合使用，实现无背景生物成像。第一种是比率探针，通过改变其发射/激发颜色来响应，典型的例子是溶剂变色探针。在显微镜下，它们的发射被分成蓝色和红色两部分，并以比率或“广义偏振”（GP）参数的形式进一步分析。第二种是荧光寿命响应探针，如荧光分子转子和翻转器，与荧光寿命成像（FLIM）兼容。最后是荧光闪烁探针，适用于单分子定位显微镜（SMLM）。目前对通过与生物膜可逆结合（PAINT）和进行光开关（STORM）的SMLM探针的研究较少，对此类探针的合成值得关注。在这篇文章中，作者重点介绍了他们团队在生物膜荧光探针方面取得的进展，以及来自其他团队的主要范例，文章以从细胞前沿-质膜-到胞内膜室-细胞器的思路撰写。
高亮度PM标记
细胞生物学家通常需要强大的工具来简单标记PM。一种传统的工具是荧光标记的小麦胚芽凝集素（WGA），其靶标是膜糖蛋白。然而，由于其体积庞大，并不总能对细胞和组织进行有效染色。早期的小分子探针是亲脂性氰衍生物，如DiI、DiD、PKH26等。它们通常水溶性较差，因此需要较高的浓度（5 μM ~ 50 nM的WGA），并提供异构标记。为了解决这些问题，作者采用两性离子锚定概念用于不同的亮度荧光团，该概念最初是为溶剂变色探针F2N12S提出的。首先，他们合成了一种甲基化的F2N12S的类似物F2N12SM（图2A），它可以用普通的紫光源激发，并且具有高量子产率和斯托克斯（Stokes）位移。它的膜染色比F2N12S亮得多，可在20 ~ 50 nM的浓度下成像。F2N12SM与绿色和红色荧光蛋白兼容，从而占据可用的蓝色通道，与用于细胞核成像的DAPI相似。其次，他们选择了一种具有高消光系数和量子产率的远红外方酸染料。令人惊讶的是，方酸探针SQ8S，一端带有两性离子基团，另一端带有烷基链（图2A），显示出有效的ER标记内化（图2B）。相较之下，在方酸两端各有两个两性离子的探针diSQ12S显示出良好的膜染色（图2B），优于单锚点的类似物。diSQ12S在低至1 nM的浓度下显示出高质量的染色，而商业标记物Vybrant DiD即使在2 μM和CellVue Claret在20 nM下也显示出异质标记。他们使用绿色染料BODIPY进一步探索了这种膜靶向策略，BODIPY分别被一个、两个和三个两性离子膜锚点功能化带有两个锚点的BODIPY衍生物（MemBright-488，图2A），显示出最亮的PM标记，这与方酸的研究结果一致。为了获得其他颜色，他们将带有两个两性离子锚点的设计概念应用于花青素染料（图2C）。所获得的探针在与脂质膜结合后会发出荧光，对PM具有高选择性，可在20 nM浓度下进行高质量成像（图2D和E）。它们兼容多种成像方式，包括组织的双光子激发成像（图2F）。在原代神经元培养中，它们对神经元和星形胶质细胞表现出一定的选择性（图2G），可以实现长期神经元成像。Membright-Cy3.5具有开/关切换行为，可对突触进行SMLM超分辨率成像（图2H）。因此，他们开发了一系列从蓝色到近红外区域的高亮度PM标记。BODIPY和花青素类似物被命名为MemBright，现在已经商业化。最近，他们报道了带有两个阴离子膜锚点（“蝴蝶”BTF探针）的荧光性氰基二聚体，由于分子内H-聚集，它们在水中不发光，但在与PM可逆结合时会发生ON/OFF切换（图2I）。它们的高亮度和缓慢的横向扩散增强了活细胞中PM的3D PAINT成像性能。其他研究团队在高亮度PM标记方面的工作包括合成聚合诱导发光染料以及用胆固醇和生物素功能化的荧光壳聚糖。
图2. 基于两性离子膜锚的高亮度PM标记。（A, C）亮膜标记的示例。激发和发射波长如图（A）所示。（B）用1 nM的SQ8S和dSQ12S（红色）孵育HeLa细胞的共聚焦显微镜图像，细胞核用Hoechst染色（蓝色）。（C）MemBright探针和（D）它们在水中或脂质囊泡中的发射光谱。荧光量子产率以%表示。（E）用MemBright-Cy7（20 nM）染色的活KB细胞的共聚焦显微镜图，正交投影由z叠加获得。（F）用Membright-Cy3.5染色（白色）染色的肝脏组织切片的双光子显微镜成像图，细胞核用Hoechst染色（蓝色）。（G）用MemBright-Cy3染色的海马原代神经元和星形胶质细胞的共聚焦显微镜图。（H）用MemBright-Cy3.5染色的海马神经元3D-STORM显微镜图。（I）用于PAINT成像的荧光二聚体探针及其在膜结合时ON/OFF原理。
对极性敏感的PM探针
极性是衡量脂质膜的一个基本参数，它可以用来评价偶极-偶极相互作用、与水的氢键作用以及溶剂弛豫的程度。正如溶剂变色染料Laurdan的开创性研究（图3A）所显示的那样，对极性和水合作用的敏感性使脂质有序成像成为可能，而脂质有序成像能够显示脂质微域的组织结构。实际上，富含胆固醇和饱和脂质的液态有序相（Lo）的特点是极性和水合作用减弱，并在溶剂变色染料的发射中观察到蓝移（图3B），这是因为紧密堆积的脂质将水从双分子层中排除，减缓了染料周围的偶极弛豫。另一个早期的例子是di-4-ANEPPDHQ（图3A），它通过发射颜色来区分两相。虽然它是针对外小叶设计的，但也可以应用在内小叶上，将其微量注射到细胞内可以对内小叶染色并监测跨膜的不对称性。然而，Laurdan和di-4-ANEPPDHQ都需要较高的浓度（>1 μM），并且前者无法对外叶/内叶精确选择。为了解决这些问题，作者将两性离子锚基团引入到溶剂变色染料尼罗红中，开发了NR12S探针（图3A）。该探针在低浓度（~ 100 nM）下显示出对脂质顺序的发射色响应和高亮度的PM染色。由于NR12S有在二亚硫酸钠存在下关闭的能力，发现NR12S与外小叶结合，翻转速度非常缓慢（在37°C下4小时后翻转率仅为9%）。NR12S在细胞膜生物学中应用广泛（现已商业化）。尽管NR12S能够监测PM中的脂质顺序及其在胆固醇提取过程中的损失，但它在细胞表面显示出相当均匀的发射颜色，这可能是因为假定的脂质微域太小且活力高。为了更好地了解PM中的相异质性，他们设计了一个带有庞大的烷基链的NR12S类似物bNR10S（图3A），它被排除在Lo相之外（Ld相染色）；还设计了带有同样庞大烷基链的黑色全淬灭剂-2 BHQ10S，它与在Ld相中淬灭了NR12S（Lo相染色）。在细胞中，bNR10S显示Ld相信号，而NR12S与BHQ10S的结合显示Lo相信号，这表明PM中同时存在Lo相和Ld相。
图3. 极性敏感PM探针。（A）溶剂变色膜探针的化学结构和（B）它们对脂质组织的颜色响应原理。（C）与生物膜不可逆（左）或可逆（右）结合的膜探针。（D）NR12A在水溶液缓冲液和不同脂质组成的脂质体中的荧光光谱。（E）用NR12A染色的由DOPC/SM/Chol组成（1/1/0.7）的巨型囊泡的共聚焦显微镜图。（F）用NR12A和NR12S（20 nM）染色的HeLa细胞的共聚焦显微镜图。（G）用NR4A（10 nM）和NR12S（20 nM）染色的COS-7细胞的3D PAINT超分辨图像。（H）用NR4A对细胞膜脂质顺序进行纳米测绘。颜色代表单分子光谱平均值（色度条）。（I）用Laurdan（上）和Pro12A（下）染色CHO细胞的共聚焦显微镜图。（J）Viologen-C12及其用于淬灭外小叶的探针。（K）不同组成的LUVs中Pro12A的荧光光谱。（L）Laurdan和Pro12A对相分离GPMVs中脂质堆积的响应。（M）从GPMVs中获得的Lo相和Ld相的GP定量，以及用甲基-β-环糊精（MBCD）提取胆固醇的CHO的GP定量。
超分辨率PAINT显微镜是一种检测溶剂变色染料膜脂组织的强力工具，它依赖于可逆的结合-解除结合过程。然而，通常用于PAINT的尼罗红会迅速分布在两个膜小叶之间并进入细胞。因此，他们设计了两种由阴离子磺酸盐和不同长度的烷基链组成的膜锚的Nile Red探针（图3A）：带有十二烷基链的NR12A用于高亲和力膜染色，带有丁基链的NR4A用于低亲和力（可逆）染色（图3C）。新探针保留了对模型膜中脂质顺序的敏感性（图3D和E），而NR12A在共聚焦显微镜下的表现优于NR12S（图3F）。因此，NR12A的阴离子磺酸盐锚点比NR12S的两性离子锚点是一种更有效的PM靶向配体。与NR12S和NR12A相反，低亲和力探针NR4A表现出高效的单分子闪烁。它可以对细胞表面进行光谱分辨率的PAINT成像，显示了以低脂阶为特征的囊泡和纤维状突起和内陷的存在（图3G和H）。因此，PM中有序相和不有序相的共存至少一定程度上与膜的几何形状有关，其中以Lo-like相为主的细胞表面含有以细胞突起或内陷形式存在的Ld-like结构。为了评估其他波长，他们将膜锚的概念应用于其他溶剂变色染料：push-pull fluorene（FR5）和Laurdan（Pro12A）（图3A）。与Laurdan相比，Pro12A对PM表现出更高的特异性（图3I）和对PM外小叶的选择性，这一点由专门设计的紫精猝灭剂viologen-c12证实，由于含有两个带正电的锚基团，它具有预期的小叶特异性（图3J）。Pro12A在模型膜和巨型PM囊泡（GPMVs）中也表现出更强的颜色变化，区分了Lo和Ld相（图3K-M），并且由于更精确的膜定位，对活细胞中的胆固醇提取响应更强（图3N）。最后，它的蓝绿色发射工作范围使其与常见的黄色和红色荧光蛋白兼容。需要注意的是，极性敏感的PM探针的应用远远不止于脂质有序成像。在此之前，他们设计了基于3-羟基黄酮的溶剂变色探针F2N12S，它揭示了细胞凋亡后由于跨膜脂质不对称性的丧失而导致PM外小叶局部极性急剧增加的现象。之后，他们发现NR12S还可以检测以红移发射为特征的细胞凋亡，并可以监测以局部极性显著增加为特征的胞吐泡的形成。最近，Feng等人开发了基于香豆素MOM33和COP的极性敏感荧光探针，这些探针在肿瘤细胞的PM处发光，因为肿瘤细胞可能表现出较低的局部极性。最后，通过使用NR12A，他们发现高渗机械应力会产生明显的PM局部极性异质性，这可能是局部膜弯曲的缘故。NR12A成像显示，氧化应激使PM的局部极性略有增加，这可能与脂质过氧化有关。这些结果为溶剂变色探针开辟了前景广阔的应用领域。
对粘度、张力和电势敏感的PM探针
PM粘度是另一个基本的生物物理参数，它直接控制着膜的动力学。荧光分子转子（图4A）可以通过抑制激发态下的分子内旋转来检测粘度的增加，从而延长其发射寿命。Haidekker等人最初以脂质共轭物的形式引入了9-（2-羧基-2-氰乙烯基）久洛尼定（CCVJ）衍生物。最近，一种带电荷肽和长烷基链的CCVJ共轭物（MRMP1，图4A）被提出用于活细胞和外泌体的PM成像。Kuimova等人基于BODIPY分子转子的两个阳离子官能化的PM探针，显示出对发射寿命和粘度的强烈依赖性（图4A和B）。这些探针揭示了猪眼晶状体高度组织化（图4C）和在氧化应激和神经保护状态下神经元膜粘度的变化。
图4. 对粘度（分子转子）、膜张力（翻转器）和膜电位敏感的PM探针。（A）分子转子探针的示例。（B）不同温度下BODIPY转子-2在甲醇/甘油混合物中的荧光寿命校准与粘度的关系。（C）在20°C时记录的寿命（τ2）分布的FLIM图像。标尺:10 μm。（D）翻转式PM探针和（E）在有序脂质环境中平面化的工作原理（红色表示Lo相，蓝色表示Ld相）。（F）用翻转器2染色的HeLa Kyoto细胞共聚焦图像。显示了等渗和高渗（机械应力）条件下的寿命值。（I）电压敏感膜探头。（J）NR12S对膜片钳HEK293T细胞跨膜电位变化的平均响应。插图显示了一个典型的NR12S标记HEK293T细胞在不同幅度的平方电压阶跃下的荧光响应。（L）基因靶向基于尼罗红的电压指示器。通过分子连接器连接到蛋白质标签上的STeVI1-Nile Red衍生物示意图。（L）神经元的电位跟踪作用。（上图）表达ACPGPI并用CoA-PEG11-NR标记的背根神经节培养细胞的宽场图像。标尺为10 μm。（下图）在电流钳位模式下从细胞体记录膜电位（上图，黑色）。单次光学记录的体细胞和轴突区域（彩色痕迹）的荧光颜色与图像（上图）中的彩色ROI相匹配。
Matile等人创造了一种非同寻常的膜探针——翻转器。这些染料改变了它们的基态构象，其中Lo相驱动它们的平面化（图4D和E），从而延长了其发射寿命。羧酸衍生物翻转器1和2可以特异性标记PM（图4D和F），而它们的机械敏感性使其能够监测细胞在机械应力下的膜张力，从而影响其荧光寿命（图4F）。为了无线监测神经元的活动，研究者在设计PM的电位探针方面做了大量工作。Loew等的早期开创性工作引入了苯基吡啶探针di-4-ANEPPS（图4G）和di-8-ANEPPS，通过电致色发挥作用。他们选择了一种3-羟色酮衍生物，经过激发态分子内质子转移（ESIPT）-敏感电场，并接枝了两条带有磺酸基的“腿”，以便使其垂直取向并深入插入生物膜中。所获得的探针di-SFA对电池中100 mV电压变化的双发射具有 ~ 15%的比例响应。此外，NR12S由于其推拉荧光团在生物膜中的垂直方向，对跨膜电位也表现出良好的敏感性（图4H）。标记GPI蛋白的类似物（图4I）可以检测神经元的动作电位（图4J）。Miller等提出了一个引人注目的概念，将荧光团与电子供体单元结合起来，进行电压敏感的光诱导电子转移（PET）。与di-4ANEPPS相比，它具有更高的灵敏度（每100 mV高达20 ~ 60% vs 6 ~ 10%），并且适用于设计荧光素、罗丹明、BODIPY等不同颜色的探针。
用于化学传感的PM探针
带有分子识别单元的PM探针能够感知细胞表面重要的生物化学物质，包括质子（pH值）、金属离子、氧化还原物质以及生物大分子，如脂类和蛋白质。因此，Zhang等将由脂质-DNA结合物组成的膜靶向单元与pH敏感的荧光素和pH不敏感的罗丹明结合在一起，实现了细胞表面pH的比率成像。为了实现对Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+、Mg2+和Cu2+等金属离子的近膜检测，他们用长烷基链对相应的离子探针进行了功能化处理。为了检测巯基，他们制作了带有膜锚点和赖氨酸残基的尼罗红衍生物，在二巯基交联剂的聚合下形成非荧光胶束（图5A）。巯基诱导胶束分解，使细胞表面发光（图5B）。最近，他们设计了一种基于FRET的探针，名为MAP，该探针由BODIPY供体组成，通过巯基敏感S-S键与膜锚和罗丹明受体偶联（图5C）。该探针可对在PM上的巯基进行比率成像（图5D），结果显示，与非癌细胞相比，癌细胞系的巯基二硫化物交换活性降低。
图5. （A）介绍巯基分解驱动的荧光开启探针的概念。（B）加入巯基（DTT）前后用纳米探针孵育HeLa细胞的荧光共聚焦图像。（C）用于巯基检测的FRET探针MRP原理。（D）用MRP染色的KB细胞在正常情况下（上图）和用半胱氨酸染色（下图，Cys）的比率成像。（E-G）用于检测细胞膜上脂质的荧光探针。（E）氨基脂类（AF488-AB1-OMe）和PS（P-IID和BPDPA-Zn）荧光探针。（F）用于检测生物膜中脂质的开启探针的设计概念。（G）分别用1 μM和3 μM staurosporine在37℃下诱导凋亡2 h的早期和晚期HeLa细胞的荧光图像，用BPDPA-Zn（绿色）和Annexin V Alexa Fluor 568染色。
一类特殊的探针是能识别脂质的PM选择性探针。Gao等报道了含有2-乙酰苯基硼酸AF488-AB1-OMe探针（图5E），它通过动态亚氨基硼酸键与含氨基脂质特异性反应，能够检测表面含有磷脂酰乙醇胺的细菌。另一个有趣的例子是含有二聚胺锌（DPA-Zn）的荧光探针P-IID（图5E），它能特异性识别磷脂酰丝氨酸（PS），从而检测细胞凋亡。最近，作者通过PEG连接器将BODIPY分子转子与DPA-Zn偶联，开发了一种PS荧光探针BPDPA-Zn（图5E和F）。该探针与PS结合后，由于局部粘度的增加而发光，从而可以免洗检测癌细胞的凋亡（图5G）。他们使用了类似的方法来检测膜蛋白-G蛋白偶联受体，其中环境敏感染料与受体配体在与蛋白质结合时会发光，这是因为染料插入到低极性的脂质环境中。将这种方法应用到尼罗红中，能够感知GPCR周围的PM脂质极性。
细胞器PM探针
除LDs外，细胞器均由脂质膜分隔。每个细胞器都承担着细胞的重要功能。例如，溶酶体消化进入细胞的分子，ER负责合成生物大分子，线粒体产生能量，高尔基体负责蛋白质和脂质运输等。为了监测细胞器膜内的脂质组织，直接的方法是使用具有细胞渗透性的亲脂性溶剂变色染料，如push-pull pyrene dye PA及其改进的类似物PK28（图6A）。用这些探针染色的细胞双色比率成像显示，极性梯度从最极性和高度有序的PM到更极性的胞内膜（图6B），这与鞘磷脂和胆固醇在PM中的优先定位一致。在用PK染色的活斑马鱼胚胎细胞中也发现了这种极性梯度（图6C和D）。此外，不同的溶剂致变色染料系统地鉴定出LDs是极性最强的结构。这种低极性使得LD成为高度疏水性荧光染料的良好目标，包括超亮二氧硼烷染料StatoMerocyanine。此外，使用近红外发射的溶剂变色二氧硼烷染料DXB-NIR，对脂质顺序表现出突出的敏感性（图6E ~ G）。因此，他们监测了亚细胞脂质结构极性的变化，在胆固醇提取、氧化应激和饥饿等外部刺激下，局部极性普遍增加（图6H）。LDs极性增加最明显（图6H），这可能是脂质过氧化产物的积累。总之，尽管非靶向溶剂变色探针在细胞器膜中的分布是非特异性，但它们可以区分亚细胞发射色结构，这种方法最近被用于多细胞器的高分辨率制图。
图6.用于脂膜组织的全细胞成像的极性敏感探针。（A）溶剂致变色染料PA和PK。（B）反映探针环境极性的红/绿比率图像和伪彩色刻度。（右图）PK探针在下列环境中的校准比率图，不同极性：DOPC、SM/Chol脂质体和Labrafac油。（C, D）受精后6 h（C）和32 h（D）不同发育阶段斑马鱼胚胎的双色比例共聚焦成像，用500 nM的PK探针染色。（D）眼睛部分。（E）溶剂变色染料DXB-NIR。（F）DXBNIR在不同组成脂质体中的归一化发射光谱。（G）用DXB-NIR染色的巨囊泡（DOPC/SM/Chol, 1/1/0.5 : Lo/Ld混合物）的双色显微镜成像：远红外通道（<640 nm）和近红外通道（>640 nm）及合并。（H）氧化应激条件下用DXB-NIR（200 nM）对HeLa细胞进行双色比率成像：2 mM H2O2, 37℃, 1 h。
为了实现特异性细胞器靶向，一种纯化学方法是用靶向配体对荧光染料进行功能化。特别是，带有PM锚点的探针，通过内吞作用会将PM与探针一起吸入内体从而达到标记的效果。虽然NR12S在4°C条件下可选择性标记细胞表面至少4小时，在室温条件下可选择性标记至少30分钟，但在37°C条件下30分钟后，很大一部分探针可标记内体的积累取决于探针电荷，因为对于两性NR12S来说，它比阳离子的FM4-64慢得多。NR12S的内体靶向被用来监测内体的成熟：在37°C孵卵2小时后观察到的红移表明，NR12S转移到内体的内小叶后，检测到胆固醇和鞘磷脂含量的下降，从而导致脂质顺序的丧失。最近，他们利用一种对染色质喹啉敏感的荧光团二聚体两性离子，研究了内体pH的变化情况。Krishnan等设计了一种基于DNA的探针，该探针结合了电压敏感的PET染料和参比染料，利用受体介导的内吞作用，对特定内吞区室的膜电位进行比率检测。标记内体/溶酶体的一种选择性策略是使用可质子化的化学配体，如N-取代吗啉，其pKa接近溶酶体的pH值。这种配体方法已成功应用于靶向其他细胞器。例如，阳离子烷基三苯磷内膜具有高的跨膜电位，因此可以将其用于不同的染料靶向线粒体。氯丙酯和五氟苯甲酰酰胺被用来靶向ER，原理是它们分别与ER的氯泵和网膜蛋白中的巯基发生反应。肉豆蔻酸被用来靶向高尔基体，因为它的功能之一是处理脂质。Matile等提出了一种研究细胞器膜生物物理特性的系统方法，即使用与上述配体偶联的翻转器。外部刺激，特别是机械应力，会使细胞的脂质顺序发生显著变化。他们将化学配体策略应用于溶剂变色的尼罗红，并获得了内体、ER、高尔基体、线粒体和LD的探针（图7A）。在显微镜下直接校准每个探针并分析绿/红荧光强度比值（I550-600/I600-650，图7B），可以直接对其进行成像和分析。比较不同细胞器的脂质顺序（图7C和D），其顺序依次下降：PM >> 线粒体 ~ ER > 溶酶体 > 高尔基体 > ER（浅探针NRERF）。亲脂性强的二环己基胺基再次成为细胞中极性最强的脂质结构（I550-600/I600-650值最高，图7）。这套溶剂变色探针工具包揭示了细胞器对外部压力的不同敏感性。LD、线粒体和溶酶体对氧化应激最敏感，其极性显著增加（即I550-600/I600-650比值降低，图7D），这可能是由于脂质氧化，而溶酶体、ER和线粒体对高渗透条件（机械应力）的反应最强。
图7. 基于化学配体策略的细胞器溶剂变色探针。（A）基于尼罗红的细胞器探针的化学结构。（B）对呈现Lo（DOPC）和Ld（SM/Chol）相的脂质体的比率共聚焦成像，用于校准探针。（C）使用细胞器探针对KB细胞的比率共聚焦成像。（D）氧化应激（2 mM H2O2，37℃，1 h）前后KB细胞中相应探针的像素间绿/红荧光强度比（I550-600/I600-650）的分布直方图。
另一种细胞器靶向策略是细胞内靶向配体和荧光团之间的生物正交反应。例如，神经酰胺衍生物Ser-TCO可以根据温度的不同定位在高尔基体或ER中，然后与自发闪烁的Si-罗丹明染料HMSiR-Tz的四嗪衍生物反应，从而实现超分辨率成像。最近，他们探索了动态共价化学方法，将尼罗红酮衍生物与位于线粒体、PM或脂滴中的酰肼配体偶联，能够在目标细胞器中定位相同的染料。特异性靶向线粒体和PM导致的光毒性明显高于LD或非靶向染料，这表明细胞器靶向可以调节生物活性。另一种有效的方法是通过蛋白质标签对细胞器进行化学标记。Kuimova等报道了分子转子BODIPY与配体的功能化，用于靶向定位于细胞质、细胞核、ER和线粒体中的蛋白质的HaloTag。使用FLIM发现了线粒体的低粘度特性，揭示了线粒体的异质性以及对机械应力和膜电位变化的响应。Matile等使用这种方法，通过优化长度的连接器，来定位带有HaloTag配体（Halo Flippers）。总之，在化学标记策略中，应该注意蛋白质偶联荧光团在脂质膜上的准确定位。脂质膜的普遍存在及其在细胞生命中的重要作用使其成为一个重要的研究课题，这促使新的化学工具——荧光探针的发展。在此，作者根据靶向原理、传感特征和光学响应，介绍了他们和其他研究小组在膜探针领域取得的的进展。在膜靶向策略中，他们重点介绍了他们合成的膜锚，形成了一个庞大的PM探针系列。感知生物膜的生物物理特性是通过设计环境敏感探针来实现的，而将识别单元嫁接到探针上则可以在生物膜上进行化学传感。尽管主要的研究工作集中在PM上，但用于标记细胞器的探针也在快速发展。非靶向探针和靶向探针，包括他们开发的溶剂变色探针，都揭示了细胞器膜的独特特征及其对细胞应激的反应。在这个前景巨大的研究方向上，前方还有许多重大挑战。首先，应实现更高的细胞器特异性，这需要利用细胞器和脂质生物化学的深层知识来设计新的配体。就PM而言，探针在内小叶的特异性定位仍然具有挑战性，关键问题是如何特异性靶向该小叶并防止探针扩散到细胞质中。另一个挑战是PM的长期成像，这要求探针具有最小的内吞作用。对脂质及其组织的感知应该与特定的膜蛋白有关，例如，通过设计能够靶向蛋白质并感知其脂质环境的生物功能探针。超分辨率技术的快速发展对适合的膜探针提出了强烈需求。在此，他们认为设计同时具有实现传感和开/关功能的探针大有可为。最终，生物膜探针应该超越细胞，实现组织和动物成像，这就要求它们具有特异性传递、适当的生物分布、低毒性以及与体内和整个动物近红外成像的兼容性。
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