分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章，文章题目是“1,2,4,5-Tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity”通讯作者是浙江大学的王毅和李新。

活性氧类(ROS)包括多种不稳定、氧化和寿命短的氧衍生物。它们相似的结构和反应性使得单一活性氧的特异性检测具有高度的挑战性。然而，为了准确阐明各种ROS在生理学和病理学中的多效作用的分子机制，并将氧化还原信号转化为有效的治疗，开发能够特异性检测目标ROS, 同时对其它ROS没有响应的强大工具是至关重要的，尤其是在活细胞中具有理想的时空分辨率。超氧化物(O₂^·-)可能是最重要的一种活性氧。超氧化物是由多种酶产生的，例如线粒体电子传递链(electron transport chain, ETC)和NADPH氧化酶(NOX)。它通过超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的变异产生H₂O₂，并为氧化还原信号传导提供其他活性氧(图1A)。超氧化物在体内的失衡能够引发氧化应激，与衰老、癌症、神经退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等的病因有关。鉴于超氧化物在氧化还原信号传导和氧化还原稳态中的关键作用，超氧化物的特异性检测一直是研究的热点。

已经开发的各种检测超氧化物的方法，包括电子顺磁共振（EPR）自旋捕获技术、电化学传感器、分光光度法、化学发光法和荧光成像法。在这些不同的方法中，荧光成像是最理想的，因为它与活细胞兼容，并允许以前所未有的时空分辨率直接在现场追踪超氧化物的动态。鉴于超氧化物在细胞中的易变性和分散性，这一优势至关重要。为此，荧光探针二氢乙锭（DHE）及其线粒体锚定的类似物MitoSOX已成为生物学中检测超氧化物的最常用工具。蓝色荧光的DHE很容易被超氧化物氧化，形成红色荧光的产物。因此，记录细胞中红色荧光的总强度已被常规用于评估细胞超氧化物的产生。虽然这种方法已经使用了约二十年，但研究表明，DHE也可以被其他ROS氧化形成红色发光产物，干扰超氧化物的成像。进一步的研究发现2-羟基乙锭是DHE经超氧化物氧化的特定产物，此后提出了2-羟基乙锭的高效液相色谱（HPLC）分析法来检测超氧化物。这种检测方法达到了预期的特异性，但这种方案却是以失去时空分辨率为代价的。事实上，由于氧化是ROS家族的一个共同特征，基于氧化的超氧化物探针通常显示出次优的特异性。为了解决这个问题，通过使用磺化和磷化的探针，开发了一些基于检测亲核ROS的探针。尽管这些探针的开发提高了对超氧化物的选择性，而不是其它ROS；水解的倾向和生物亲核物（如谷胱甘肽）的大量存在仍然损害了它们的特异性。开发具有理想特异性的荧光探针用于细胞内超氧化物的时空成像仍然是一项艰巨的挑战。

基于以上科学问题，作者报告了设计和开发了一系列基于活性的传感（activity-based sensing, ABS）探针，以前所未有的特异性对活细胞中的超氧化物进行成像。这些探针是根据超氧化物的还原性开发的，并利用超氧化物向1,2,4,5-四嗪（Tz）的单电子转移作为反应机制。由于Tz固有的荧光淬灭能力，这些探针在超氧化物刺激下显示出荧光增强。通过调整探针的反应性和发射波长，以前所未有的空间分辨率实现了细胞超氧化物水平的多重成像。鉴于探针设计方案的普适性，作者建立了一种高内涵的药物筛选模型，并确定了一种天然产品来减轻缺血性心脏病病理中氧化应激引起的损伤。作者设想，这些基于Tz的探针的反应特异性和荧光增强将使它们成为在一系列病理生理学环境中追踪超氧化物的非常有用的工具。

首先，作者通过在四嗪两侧的取代基修饰不同具有电子推拉能力的基团，以及不同空间位阻的取代基来调节四嗪与超氧阴离子自由基的反应效率，实验结果表明吸电子取代基和更小的空间位阻有利于四嗪去超氧阴离子自由基的反应（图1）。这对于后续荧光探针的设计提供了有力指导。

接下来作者将甲基取代基的四嗪引入萘和喹啉荧光团，结合不同的氨基取代基，构建了四种不同发射波长的超氧探针F-Tz1-4，对这四种探针与超氧阴离子自由基的荧光检测结果显示，均具有超高的选择性识别能力（图2）。而且探针对其它活性氧具有很好的稳定性，即使在2 mM的H₂O₂存在的情况下依然非常稳定。所以在大浓度H₂O₂刺激下，细胞发生氧化应激会导致超氧阴离子自由基的高表达，特异性清除剂处理组表明本工作中所报道的探针对超氧具有更好的选择性，而市售的荧光探针容易受到其它ROS的干扰，不能准确的反应超氧阴离子自由基的浓度波动。

最后，作者测试了Coprostanone在心肌I/R损伤小鼠模型中的心脏保护作用（图3）。为了进一步研究前列素酮的潜在药理机制，作者采用蛋白质印迹法分析了心肌组织中氧化应激相关蛋白的表达，发现NRF2介导的转录抗氧化程序，包括其下游因子HO-1和SOD2，受到前列酮治疗的显着调节。虽然Coprostanone诱导心脏保护的确切机制仍有待探索，但其抑制超氧化物过载的作用已经确定，NRF2-HO-1/SOD2信号通路的增强可能在这种作用中发挥作用。

总之，本文报道的这些基于Tz的探针具有前所未有的特异性和空间/时间分辨率，将保证在广泛的病理条件下进行大量应用。同时作者认为，尽管在这项工作中进行了简单的探针构效关系研究，但这远远不足以获得最灵敏的探针。对于那些在蓝紫色或红色区域发射的探针尤其如此，大多数探针与超氧化物反应后的量子产率仍然很低，需要进一步提高其灵敏度。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-37121-8.