分享一篇发表在Chemical science杂志上的文章，题目为“Photo-Brook rearrangement of acyl silanes as a strategy for photoaffinity probe design”。文章的通讯作者是来自美国加州大学伯克利分校化学系的Daniel K. Nomura教授和F. Dean Toste教授，Daniel K. Nomura教授课题组的主要有三个研究方向：1）开发和应用化学蛋白质组学支持的共价配体；2）利用化学蛋白质组学平台来扩大靶向蛋白质降解技术的范围。3）使用化学蛋白质组学支持的共价配体发现平台来开发新的基于诱导接近的治疗方式。F. Dean Toste教授课题组主要的研究方向是针对催化剂、催化反应和有机合成方法的开发。

本文主要合成了一种光交联亲和探针，它是基于紫外诱发的1,2-photo-Brook重排反应，并将其与小分子(+)-JQ1等抑制小分子结合，实现与BRD4-BD1等蛋白的选择性交联。

光亲和标记（Photoaffinity labeling，PAL) 是一种能够利用光交联反应鉴别活性小分子与蛋白质的结合位点的工具，广泛应用于药物化学、化学生物学、生物化学等领域。光亲和标记是在特定光照下可以捕获瞬时的非共价小分子-蛋白质相互作用，从而发现新的靶标。传统的光亲和探针有双吖丙啶、芳基叠氮和二苯甲酮，在紫外光照下分别生成对应的卡宾、氮宾和羰基自由基中间体。理想的光亲和标记探针需要具有长波长的紫外吸收曲线，以最大限度地减少辐照过程中的细胞和蛋白质损伤，快速生成能够与残基无关的交联的短寿命反应中间体，并将天然底物-蛋白质相互作用的干扰降至最低。酰基硅烷是一种有趣的官能团，具有理想的特性，可以用作光亲和探针。经紫外照射后，酰基硅烷会发生1,2-photo Brook重排以得到稳定的中间体α-siloxy carbene，之前的研究发现该中间体可以以较高的产率插入各种酸性、极性和非极性键。

首先作者合成了一个探针（图1），该探针含有炔基和酰基硅烷，并评估了不同硅烷取代基对光反应效率的影响。这些不同的取代基探针都具有364-370 nm 之间的长波长 UV λmax，说明其非常适合做亲和探针；另外还评估了不同取代基探针在MeOH中的反应性。为避免可能对目标蛋白质或其他蛋白质造成损害，光亲和探针应具有较短的照射时间；与此一致，所有三种酰基硅烷在用简单的6W手持式紫外线灯照射后，在30分钟内都显示出 80% 及以上的转化率（图2）。

图1. 酰基硅烷15a-c的合成

图2. 酰基硅烷探针在MeOH-d4中的紫外辐照动力学曲线。

评估完酰基硅烷探针的光活性后，作者测试了它们在细胞裂解液中的标记能力。将三种取代基的探针与细胞裂解液孵育不同时间后紫外照射30min，探针上的炔基与含有叠氮的罗丹明进行点击反应，最后通过胶内荧光观察标记的蛋白。所有探针显示出蛋白质的光依赖性标记以及标记的增加（与DMSO对照相比）。iPr取代的酰基硅烷15c在实验结果中显示背景信号没有增加，并且荧光最强。相比之下Me取代的15b和Ph取代的15a，在延长孵育时显示出增加的背景信号（图3）。

图3. 细胞裂解物中PAL探针15a-c的紫外依赖性标记的凝胶成像

作者测试酰基硅烷探针（如iPr衍生物15c）是否可用于捕获目标和特定的小分子-蛋白质相互作用。作者利用iPr取代基制备了两种小分子酰基硅烷探针。第一种是基于BET 类溴结构域蛋白抑制剂(+)-JQ1，另一种是基于FKBP12抑制剂雷帕霉素。将这两类探针分别与纯化的BRD4-BD1和FKBP12蛋白孵育后进行紫外交联，随后用含有叠氮基团的罗丹明进行荧光标记继而胶内成像。发现具有较短接头(16)的探针有更强烈的荧光。由于这两种探针都可以用过量 (+)-JQ1 预处理 BRD4-BD1 来抑制，说明该数据不是由酰基硅烷部分与蛋白质靶标的非特异性结合引起的（雷帕霉素也是同理）（图4）。

图4. (+)-JQ1 (16和17)和雷帕霉素光亲和探针(18和19)分别与蛋白BRD4-BD1 和 FKBP12 标记的凝胶成像

最后，作者确认了酰基硅烷探针能够捕获蛋白质组中的靶向和特异性相互作用。主要将双吖丙啶基团的探针和酰基硅烷的探针分别与细胞裂解液进行孵育后紫外交联，比较发现作者开发的亲和探针与之前报道的双吖丙啶基团的探针的能力相当（图5）。

图5. (+)-JQ1光亲和探针（16、16Me、16DA）在231MFP细胞裂解物标记的凝胶成像

总之，本文确定了一类新型光亲和探针，其辐照时间短，能够生成 α-甲硅烷氧基卡宾中间体，适用于在长紫外波长下在细胞裂解物和纯蛋白质中进行光亲和标记应用。

文章作者：YJ

原文引用：doi.org/10.1039/D2SC00426G

责任编辑：LD