分享的是一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，通讯作者是Simon Fraser University的David J. Vocadlo教授，David J. Vocadlo是加拿大化学糖生物学研究主席，其课题组致力于开发和利用新的化学工具来揭示聚糖和糖基转移酶/水解酶疾病中的作用。了解酶在其生理相关环境中的功能和调节需要报告其细胞活动的质量工具，本文中，作者开发了一种基于双缩醛基（BABs）的荧光猝灭底物—细胞活性glyco-BABSs探针，可用于疾病相关的人类α-半乳糖苷酶（α-GALA）和α-N-乙酰半乳糖胺酶（α-NAGAL）活性的定量。作者进一步证明，这些底物能够测量来自不同Fabry病突变患者组织中的残余酶活性，以及抑制剂的靶向作用、药理伴侣的作用、运输受损或溶酶体稳态干扰。这些BABs底物可广泛用于研究细胞内糖苷酶的调节以及促进这一重要酶类的诊疗试剂的开发。

首先，作者设计并合成了基于双缩醛基的第一代和第二代Glyco-BABS探针，其可被α-GALA或α-NAGAL识别并水解，从而将荧光基团从Glyco-BABS探针中释放出来，以用于监测溶酶体中α-GALA或α-NAGAL的酶活性。

本文中，作者设计了两种Glyco-BABS探针，分别命名为α-Gal-H-EDANS BABS和α-GalNAc-H-EDANS BABS，它们都可被α-GALA或α-NAGAL水解；并且α-Gal-H-EDANS BABS在α-GALA和α-NAGAL的作用下呈现浓度依赖的反应速率增加，但α-GALA的作用效果更为显著，而α-GalNAc-H-EDANS BABS仅在α-NAGAL的作用下呈现浓度依赖的反应速率增加，这一结果也表明这两种探针呈现一定的特异性。同时，作者还发现第二代Glyco-BABS探针的反应速率显著高于第一代Glyco-BABS探针。

接下来，作者设计并合成了可用于活细胞成像的Glyco-BABS探针，分别为α-Gal-H-TMR BABS和α-Gal-H-TMR BABS，下图中，Migalastat是α-GALA的抑制剂，DGJNAc为α-NAGAL的抑制剂，在这两种抑制剂的作用下可分别降低α-GALA和α-NAGAL的酶活性。在Migalastat作用下，由于对α-GALA的抑制导致α-Gal-H-TMR与LysoTracker共定位的降低，此外，随α-Gal-H-TMR BABS作用浓度及作用时间的增加，TMR荧光信号也不断增强。

在验证了上述两种Glyco-BABS探针的有效性后，作者还将α-Gal-H-TMR用于Fabry患者成纤维细胞中α-GALA活性和水平的定量，结果表明α-Gal-H-TMR BABS可定量监测正常的成纤维细胞和α-GALA突变的成纤维细胞中的α-GALA活性和水平。

最后，作者检测了Fabry患者成纤维细胞在Migalastat和DGJNAc处理下，α-Gal-H-TMR BABS定量监测溶酶体α-GALA活性的效果，结果显示α-Gal-H-TMR BABS对于成纤维细胞中的α-GALA活性检测的特异性较好，α-GALA突变的成纤维细胞中，可能由于α-GALA高级结构的改变导致DGJNAc也可抑制α-GALA活性。此外，采用Monensin和Brefeldin A（可抑制通过分泌途径到溶酶体的转运），及Bafilomycin（诱导溶酶体脱酸）这3种抑制剂处理Fabry患者成纤维细胞后，α-Gal-H-TMR BABS可监测到α-GALA活性的显著降低。

综上，本文设计并合成了基于双缩醛基（BABs）的荧光猝灭底物—细胞活性glyco-BABSs探针，并成功用于Fabry患者成纤维细胞中α-GALA的活性和水平的定量监测，该策略提供了一种生理学相关的基于活细胞的分析方法，可用于Fabry和Schindler/ Kanzaki等疾病的机理研究，针对其他糖苷水解酶的BABS探针的开发也将对更多的疾病研究起广泛作用，有助于新疗法的发展。

文章作者：MXF

原文引用：10.1038/s41589-021-00960-x

责任编辑：LD