一种优化的同位素光裂解标记策略,用于对结直肠癌转移中蛋白质 O-GlcNAcylation 位点特异性定量分析

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分享的是一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章,标题为“An Optimized Isotopic Photocleavable Tagging Strategy for Site Specifific and Quantitative Profifiling of Protein OGlcNAcylation in Colorectal Cancer Metastasis”,通讯作者是北京大学化学与分子工程学院的陈兴教授。陈兴教授课题组的研究领域集中于化学糖生物学和生物纳米技术,主要包括:活细胞及活体中聚糖的化学标记、糖合成、成像和组学分析、糖基化在神经系统和干细胞中的功能、糖代谢与糖基化的内在联系、基于生物正交反应的化学生物学技术。

本文开发了一种O-GlcNAc图谱的同位素光裂解标记策略(isoPTOP),能够定量和位点特异性分析O-GlcNAcylation,具有良好的特异性和敏感性。将此策略运用到HeLa细胞中,鉴定出约1500个O-GlcNAcylation位点,并采用isoPTOP对这些O-GlcNAcylation位点进行定量。此外用isoPTOP研究了一对结直肠癌(CRC)细胞系SW480和SW620细胞的O-GlcNAcylation动态变化,主要发生在参与肿瘤进展和转移的重要调控因子上。此方法为理解O-GlcNAc在CRC中的功能提供了一个有价值的数据库。isoPTOP也适用于各种病理生理过程中O-GlcNAcylation动力学的研究。

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O-连接-β- N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)修饰普遍存在于多细胞动物的核、细胞质和线粒体蛋白上,截止到目前为止,已鉴定出数千种 O-GlcNAcylated 蛋白,它们大多带有多个不同化学计量的 O-GlcNAcylation 位点。异常的O-GlcNAcylation与多种疾病相关,因此蛋白质O-GlcNAcylation位点特异性和定量分析对于了解 O-GlcNAc 生物学和病理学间的关联至关重要。

基于此已开发了多种方法用于蛋白质O-GlcNAcylation量化分析,如无标记定量 (LFQ)、细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(SILAC)、用于相对和绝对量化的等压线标记(iTRAQ),但LFQ受限于稳定的液相色谱性能,SILAC 和 iTRAQ肽富集和同位素标记分两步操作,可能会导致样品丢失。鉴于上述方案的弊端和 O-GlcNAcylation 位点的规模庞大,亟待开发的位点特异性、大规模量化 O-GlcNAcNAcylation、具有出色的特异性和灵敏度的新方法。基于此,本文作者开发了isoPTOP策略来解决上述问题。

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图1. O-GlcNAcylation位点蛋白质组学鉴定方法的优化


为了识别蛋白质O-GlcNAcNAcylation位点,首先用叠氮化合物(GalNAz)对 O-GlcNAc 进行化学酶标记。然后,叠氮标记的 O-GlcNAcylated 蛋白与含有可切割接头的炔烃-生物素发生点击化学反应,使链霉亲和素能够捕获并释放 O-GlcNAcylated 肽,最终对所得肽进行质谱分析。作者尝试通过优化 O-GlcNAcylated 肽富集和串联质谱(MS/MS) 解离来提高 O-GlcNAcylation 位点的覆盖率。对于O-GlcNAcylated 肽富集,作者设计了两种类型的炔烃-生物素标签:炔烃-PC-生物素(光裂解标签)和炔烃-AC-生物素(酸裂解标签)。对于质谱检测比较了两种方案:方案一:采用高能碰撞解离 (HCD,能实现高效的肽段裂解) 和电子转移解离 (ETD,主要用于O-GlcNAcylation 位点检测)偶联检测方案(EThcD ),实现了肽骨架片段化效率的提升和高覆盖率;方案二:采用HCD和EThcD 二次偶联(HCD pd ETHcD) 进行质谱检测,通过选择具有特征 HCD 片段的肽段进行 EThcD 分析,进一步提高效率和覆盖率(图1A)。

将上述方案在Hela细胞中实验发现,用HCD pd EThcD方法检测到的总肽谱匹配(PSMs) 和含 O-HexNAc PSM (O-PSM) 数量显著高于EThcD方法。HCD pd EThcD二次偶联比EThcD能提供更多的MS/MS谱图信息。比较两种炔烃-生物素标签发现:两组的总 PSM 数量相似,炔烃-AC-生物素标记组中 O-PSM 的数量是炔烃-PC-生物素标记组的 50%。炔烃-PC-生物素在鉴定O-HexNAc肽方面具有更好的性能(图1B和C)。作者还对此方案在识别 O-GlcNAc 位点数量方面进行实验,发现炔烃-PC-生物素标记结合HCD pd ETHcD在实验过程中略显优势(图1D)。

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图2. 同位素光裂解标记O-GlcNc图谱(isoPTOP)策略的开发


在实现蛋白质O-GlcNAcNAcylation位点的识别后,作者接下来尝试量化蛋白质上的O-GlcNAcylation。为有良好的重现性,对O-GlcNAcylation位点识别的影响降到最低,作者采用同位素标记法。合成了一对同位素标记的炔烃-PC-生物素:轻链型(alkyne-L-PC-biotin)和重链型(alkyne-H-PC-biotin)(图2A)。捕获的O-GlcNAcylated肽段经光裂解,同位素部分(“轻”或“重” N- ( l-缬氨酰基-氨基甲基三唑基乙酰基)半乳糖胺,即NVAMTG)留在O-GlcNAc部分上,可以使用轻/重比定量O-GlcNAcylation位点。

作者将上述两种同位素标记的炔烃-PC-生物素及无同位素标记的对照组与细胞裂解液反应来评估二者的标记和切割效率。SDS-PAGE 结果表明,三种生物素标签产生了相似的蛋白质条带(图2B)。表明同位素标记的炔烃-PC-生物素可用于高效富集O-GlcNAcylated蛋白和肽。此O-GlcNAc图谱的同位素光裂解标记策略(isoPTOP)延用于后续实验。

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图3. 使用 isoPTOP 策略识别和量化 O-GlcNAcylation 位点


针对这一策略作者进一步进行了评估,将化学酶标记的细胞裂解液分别与Alkyne-L-PC-biotin和Alkyne-H-PC-biotin反应,裂解物以 1:1 的比例混合并用胰蛋白酶消化,然后链霉亲和素捕获。O-GlcNAcylated 肽通过紫外线裂解从链霉亲和素珠中释放后进行 LC-MS/MS 分析(图3A)。质谱结果如图3B所示,HCD pd ETHcD 碎片保留了不稳定的 O-糖苷键,从而实现 O-GlcNAc 位点的判定。为了量化这些识别的位点,作者做了L/H-NVAMTG-GlcNAc修饰肽的MS1离子色谱图,并计算其相对比率 (图3C)。3组重复分别定量了658、617和625个O-GlcNAcylation位点,共得到1004个位点,平均配比分别为1.02、0.99和1.00,与1:1的预混合比例匹配良好,且三组结果表现出良好的重现性(图3D)。

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图4. 原发性和转移性CRC细胞中O-GlcNAcylation位点的定量和位点特异性分析


作者将这一策略应用于结直肠癌 (CRC) 中 O-GlcNAcylation的研究。SW480 和 SW620是一对来自同一患者原发肿瘤和淋巴结转移的等位基因结肠癌细胞株。作者首先用Y289L标记GalT1和UDP-GalNAz与炔-生物素反应,并使用抗生物素抗体进行免疫印迹,分析了SW480和SW620细胞中O-GlcNAc的总体水平。SW620细胞的O-GlcNAcylation水平高于SW480细胞(图4A)。然后用isoPTOP对细胞裂解液分析,具体操作流程如图4B所示。SW480 和 SW620两组细胞的3次重复有良好的重现性,重复之间的 O-GlcNAc 位点的量化也表现出很强的相关性(图4C)。

基于此,作者进一步分析了O-GlcNAcylation在特定修饰位点的变化。首先检测了SW480细胞和SW620细胞之间O-GlcNAcylation位点的相对丰度(图4D)。实验结果分析表明:SW480细胞中分布在41个蛋白上的54个O-GlcNAc位点O-GlcNAcylation水平显著上调;SW620细胞中分布在141个蛋白上的242个O-GlcNAc位点O-GlcNAcylation水平显著上调。经GO(Gene ontology)分析表明,SW480细胞中上调的O-GlcNAcylated蛋白具有“锌离子结合”、“核定位序列结合”和“核孔结构成分”等功能(图4E,红色部分)。SW620 细胞中的上调蛋白具有“DNA 结合”和“参与细胞-细胞粘附的钙粘蛋白结合”等作用(图4E,蓝色部分)。此外,肿瘤生长和转移过程中重要调节因子也存在O-GlcNAcylation的改变,图4F给出了具体的变化情况。柱状图显示了癌症相关过程中调控因子上特定O-GlcNAcylation位点的相对丰度。(A.上皮细胞向间质转化(EMT);B.调节上皮细胞增殖;C.细胞迁移;D.血管生成;E.Wnt信号通路的调控)。这一发现对于肿瘤发生和转移机制的研究具有指导意义。


综上所述,本文开发了isoPTOP策略用于蛋白质O-GlcNAcylation定量分析,采用光裂解生物素标签与高效的HCD pd EThcD MS/MS裂解方法相结合,对O-GlcNAc蛋白质组的研究具有较高的覆盖率。同时通过使用一对同位素编码的炔烃-PC-生物素探针对 O-GlcNAcylation 位点特异性量化。isoPTOP 策略可以对 O-GlcNAcylated 位点进行富集、同位素标记和定量,具有出色的特异性和灵敏度。为检测O-GlcNAc在各种生理病理过程中的动态变化提供了指导意义。


本文作者:CTX

DOI:10.1021/acschembio.1c00981

责任编辑:LD


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