给大家推荐一篇发表在JACS上的文章，文章标题是“Catalytic Activation of Bioorthogonal Chemistry with Light (CABL) Enables Rapid, Spatiotemporally Controlled Labeling and No-Wash, Subcellular 3D-Patterning in Live Cells Using Long Wavelength Light”。其通讯作者是来自辉瑞研发总部的Christopher W. am Ende和美国Delaware大学的Joseph M. Fox，他们课题组专注于研究发展新型化学反应，尤其是关注这些反应与具有生物学功能的小分子结合后的应用，以及在生物和材料科学中的应用。本文中，首先基于不活泼的二氢四嗪(DHTz)在细胞内环境中被周围的氧气光催化氧化，产生四嗪，四嗪与反式环辛烯(TCO)亲二烯试剂发生反应的前提，通过HaloTag自标记平台，将DHTz标签引入到定位于细胞核、线粒体、肌动蛋白或细胞质中，在光催化剂和光照情况下，DHTz生成活泼的四嗪，利用四嗪与TCO的反应进行亚细胞水平的标记，即本文中提出的光催化的生物正交反应，在活细胞水平实现时空分辨的标记策略。

生物正交化学的用途非常广泛，基本上可以应用于任何可以结合化学报告基团的生物分子，因此已被用于标记甘聚糖、脂质、核酸和蛋白。由于其在生命体系研究中的优势，未来新的生物正交标记方法在生物学和医学上的应用前景也是非常广阔的。光化学在化学生物学中追踪活细胞中的生物分子动态具有重要作用，其中，光激活蛋白已经成为直接研究亚细胞分子的工具，即光催化下，这些小分子呈现荧光，相比荧光蛋白，这些小分子具有更强的荧光，但是其生物相容性有待于进一步发展。

光激活生物正交化学是一种用于标记生物分子光响应的替代方法。之前就有各种基于生物正交反应发展而来的光催化的生物正交反应。比如基于Staudinger连接反应、CuAAC反应发展而来的光催化生物正交反应。其中也有很多基于四嗪连接反应发展而来的新型反应，并将其应用在活细胞标记中。

其中氧化诱导四嗪连接反应也是重要的一类新型生物正交反应，该课题组之前利用660 nm光激发下催化光氧化的亚甲基蓝，催化DHTz转化成四嗪，进而在通过与TCO之间的反应实现活细胞的标记。但由于亚甲基蓝对单线态氧的增感引起的光毒性，在活细胞中的应用有限，本文发现了硅罗丹明可以作为DHTz氧化的光催化剂，DHTz氧化比单线态氧敏化更快，因此光催化活化四嗪连接可用于蛋白质修饰，同时减少了氧化损伤。

首先，作者介绍，在CABL策略中，带有DHTz标签的小分子靶向亚细胞器，在生物正交化学中处于惰性状态。在光催化剂和光的存在下，休眠的DHTz转化为高度活性的四嗪，然后可以进行快速的生物正交化学反应。将CABL策略与双光子激发相结合，在反应发生后不洗涤细胞时，通过实时成像，有可能在亚微米空间分辨率的3D中选择性地绘制亚细胞结构。

Figure 1 光催化生物正交化学策略(CABL)实现时空可控的标记亚细胞

通过合成一系列DHTz的衍生物，和TCO的衍生物，通过小分子实验，对比反应速率，确定最终修饰到生物分子上的结构，即1a和a-TCO。

Figure 2 硅罗丹明或荧光素染料催化二氢四嗪(DHTz) 1被氧氧化生成四嗪

通过体外小分子水平的实验，即将Halo-DHTz和a-TCO的反应，确定本文提出的策略在蛋白水平上可以实现。

Figure 3 质谱确定小分子水平1a与DHTz反应可以发生

接下来，作者使用CABL策略实现活细胞中的标记，并且可以在细胞内多个靶点实现标记。首先利用HaloTag自标记平台将DHTz引入到哺乳动物亚细胞器和细菌上，然后用光催化剂（包括荧光素催化剂FDA/FL或SIR光催化剂）和a-TCO-TAMRA或o-TCO-TAMRA标记DHTz，通过SDS-PAGE表征，发现随着照射时间的增加荧光标记不断增加，在使用荧光素催化剂标记细胞核蛋白时，照射5 min时最大标记量达到95%，同时发现SiR-tJF646可以作为光催化剂在660 nm光照下实现线粒体蛋白的标记，并且标记在30 min时接近最佳标记效果。

Figure 4 CABL策略可以实现活细胞中的标记

然后作者对比实验结果发现，用CABL策略标记细胞和使用TAMRA-Halo直接标记效果相当，但是用传统的四嗪MeTzHalo标记HaloTag-H2B-GFP，然后用o-TCO-TAMRA标记，效率很低，根据之前的研究结果，推测原因可能是细胞环境中四嗪基团被还原，通过将反应效率较低的化合物9和GSH孵育，在261 nm光照下，发现其吸收值降低至12%，即GSH和化合物9的孵育可能导致四嗪被还原为化合物9，表现出261 nm吸收值降低，但是在660 nm照射下，吸收值迅速升高，即体系内四嗪能够维持原本状态继续进行反应，这也证明了作者的猜测，利用这一结果，将化合物9和SiR-tJF646联合使用标记HaloTag-H2B-GFP，发现标记效果与使用TAMRA-Halo直接标记效果相当。

Figure 5 CABL策略提高了四嗪连接反应的效率

紧接着，作者使用HeLa细胞转染POI，该POI是融合来GFP-HaloTag的控制亚细胞定位的蛋白，然后用小分子DHTz-Halo进行标记。发现CABL策略可以实现不同亚细胞器的标记。

Figure 6 CABL策略可以标记活细胞中的亚细胞器

之后，作者利用双光子成像模式，发展了免水洗的细胞核上光图案标记模式，即在表达HaloTag-H2B-RFP的细胞核中，使用880 nm激活荧光素，进而实现光照区域中CABL策略的标记。同时对标记效果进行定量，即将细胞外的荧光强度归一化，被照射的区域，荧光强度比背景增加了一个数量级，而非被照射的区域没有变化，因此标记效果较好，另外，对光照时间进行研究，发现光脉冲后荧光强度迅速增加然后稳定下来，然后在三个光脉冲后，达到最大荧光强度。

Figure 7 由CABL策略发展而来的免水洗的光图案标记模式可以标记细胞核

接着，作者发现CABL策略可以实现内源性MAGL的时空分辨标记，首先构建了一种用于共价修饰单酰基甘油脂肪酶(MAGL)的DHTz探针，该探针可以通过四嗪连接反应，实现对内源性的MAGL的标记，首先作者利用胶内荧光对标记效果进行表征，并且定量结果发现IC50和MAGL的抑制剂KML-29相当。通过胶内荧光实验确定标记条件需要探针、FDA、光照同时存在。同时，荧光共聚焦成像结果也显示出免洗模式仍然适用，通过脉冲实验证明荧光信号只在光激活过程中增强，6次光脉冲后荧光强度达到饱和。

Figure 8 CABL策略可以实现内源性MAGL的标记

最后，作者采用全内反射荧光(TIRF)显微镜研究CABL策略标记内源性MAGL，表明其具备一定的空间分辨的标记活细胞的能力。同时用旋转圆盘共聚焦显微镜获得了样品的z形堆叠图像。

Figure 9 全内反射荧光显微镜表征CABL策略标记内源性MAGL具有空间分辨性

本文作者：WFF

DOI：10.1021/jacs.1c10390

责任编辑：LD