分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Chemoenzymatic and Synthetic Approaches To Investigate Aspartate- and Glutamate-ADP-Ribosylation”，本文通讯作者是德克萨斯大学西南医学中心生物化学系的Glen Liszczak老师，他们课题组主要研究的是突变和异常蛋白质翻译后修饰导致疾病发生的生化机制。
蛋白质的ADPr修饰是在酶的催化下，来自NAD+的ADP核糖基团转移到蛋白上，单ADPr修饰的蛋白可以直接参与到各种生理过程的调节中，也可以继续形成聚ADPr修饰，许多参与调节ADPr修饰的相关蛋白已经被确定为人类疾病的治疗靶标。最近，新的合成和化学酶法已经被开发出来用于在全长蛋白的特定部位插入ADPr修饰，但目前的研究主要集中在丝氨酸侧链上插入ADPr修饰；天冬氨酸和谷氨酸的ADPr修饰在细胞中常常可以观察到，具有一定的化学复杂性，因此作者在本文开发了高效的化学酶法和全合成方法在肽的Asp/Glu残基上插入ADPr修饰。首先，作者纯化了一些已知的ADPr转移酶，希望寻找到可以在合成的肽底物丝氨酸以外的的氨基酸上插入ADPr修饰。通过实验，他们发现PARP14（PARP14cat+）可以有效地将底物上的Asp/Glu进行单ADPr修饰，经过实验条件优化，酶的转化效率可以超过50%，且不含Asp/Glu的肽底物不会被修饰，将底物肽中Glu突变为Ala之后也不会发生ADPr修饰，这证明作者找到了一个可以有效且特异性地在合成肽的Asp/Glu上插入ADPr修饰的酶。随后，作者制备了各种包含内源性人类Glu-ADPr位点的肽段，检测PARP14cat+对底物的选择性，发现该酶可以在肽的Glu位点安装ADPr修饰，将Glu突变为Ala之后则没有观察到ADPr修饰的出现，说明该酶对底物序列没有选择性。
对肽底物ADPr修饰的产物进行NMR分析，发现Glu/Asp的ADPr修饰会从异头碳到核糖2‘-OH或3’-OH迁移，且形成的产物成比例分布。且用实验证明该现象在细胞内和细胞外都存在。作者通过在树脂上进行磷酸化和焦磷酸化得到了ADPr修饰的肽段。对ADPr修饰的肽段进行pH和热稳定性实验，发现Asp-ADPr和Glu-ADPr修饰比Ser-ADPr修饰更热敏感且对碱性条件也比较敏感。
之后，作者证明化学酶法合成得到的ADPr修饰的多肽可以应用到ADPr修饰相关的生化分析中，然后作者将Asp/Glu-ADPr化的肽组装成全长的蛋白质，得到了全长的组蛋白H2B在Glu2位点上带有三个ADPr修饰（ADPr3），组装了半合成的核糖体，发现组蛋白尾部的Asp/Glu-聚ADPr使核糖体对ALC1依赖的染色质重塑活性敏感。综上所述，作者开发了化学酶法和固相合成的方法合成Asp/Glu-ADPr修饰的肽。
本文作者：LZ
责任编辑：WFZ
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c03771
文章引用：10.1021/jacs.3c03771
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