蛋白质翻译后修饰 (Post-translational modifications, PTMs) 在调控蛋白功能上发挥着重要作用。修饰率 (stoichiometry) 是指带有修饰的蛋白在整个蛋白中所占的比例，是描述翻译后修饰的重要指标。目前已有的研究表明泛素化、赖氨酸乙酰化、磷酸化和 S-亚磺酰化修饰率的高低会影响相关修饰位点的功能。

与此同时，研究者们利用质量标签 (mass tag) 的技术在单蛋白水平上成功地对 O-GlcNAc 修饰、S-脂肪酰化修饰的修饰率进行了直接定量，但目前该技术还未推广到组学水平。

近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心的王初教授团队发展了一种名为”STO-MS”(quantitative profiling of STOichiometry by Mass Shift) 的化学蛋白质组学策略，将靶向特定翻译后修饰的化学探针与质量标签通过“点击化学”进行结合，进而通过定量蛋白质组学技术实现了在组学水平上对脂质过氧化修饰之一的 4-羟基壬烯醛 (HNE) 修饰率的定量。

STO-MS 策略的流程主要包含以下几步：

• 首先将质量标签通过“点击化学”反应引入到化学探针标记后的蛋白上，然后通过 SDS-PAGE 电泳进行分离。

  由于质量标签自身的分子量，带有不同数量翻译后修饰的蛋白在凝胶中的迁移距离也不同。

• 随后研究者根据质量标签的分子量将凝胶切开，并进行胶内酶切。

  在每份样品混合了 SILAC 标准样品后，所有样品进行 LC-MS/MS 的分析。

• 最后通过对质谱数据的分析得出蛋白的修饰率。

在本工作中，研究者选择了脂源性亲电小分子 4-羟基壬烯醛 (HNE) 作为研究对象。HNE 是一种 α,β-不饱和醛，它可以共价地连接在半胱氨酸 (Cys)、赖氨酸 (Lys) 和组氨酸 (His) 等亲核氨基酸残基上形成羰基化修饰。

为了验证 STO-MS 策略，作者利用 HNE 的生物正交探针 HNEyne 和分子量为 2,000 Da 的质量标签 N₃-mPEG-2000 进行了研究。

研究者首先在单蛋白水平上进行了该策略的可行性验证。纯蛋白 BSA 和 HNEyne 探针孵育后，随后通过点击化学与质量标签 N₃-mPEG-2000 偶联，最后通过凝胶电泳实现对带有不同数量质量标签的蛋白进行分离。作者利用 BSA 模型系统地优化了质量标签偶联的效率。随后，研究者借助非天然氨基酸定点插入技术构建了带有炔基基团的绿色荧光蛋白 GFP，并证明了在 10 mM N₃-mPEG-2000 条件下可以实现质量标签的完全偶联。最后作者在细胞裂解液中进行了验证，并成功地在已知的 HNE 修饰蛋白 ZAK 上观察到了质量迁移条带，而当 ZAK 中的 HNE 修饰位点突变后，质量迁移条带也随之消失。

研究者通过将质量标签与高分辨质谱结合，开发了用于定量翻译后修饰率的化学蛋白质组学平台 STO-MS，并成功在组学水平定量了 HNE 修饰率。该策略可以与化学直接捕获探针、代谢标记探针和酶法标记探针进行联用，为其他研究者提供了研究翻译后修饰的有力工具。

感谢国家自然科学基金委“生物大分子动态修饰和化学干预”重大研究计划和北京分子科学国家研究中心对本工作的经费支持。

• Quantitative profiling of PTM stoichiometry by resolvable mass tags
  Ying Chen‡, Baiyi Quan‡, Yuanpei Li‡, Yuan Liu, Wei Qin and Chu Wang*(王初，北京大学)

  RSC Chem. Biol., 2022, 3, 1320-1324
  https://doi.org/10.1039/D2CB00179A

王初 教授

北京大学

王初，北京大学化学与分子工程学院教授，北大清华-生命联合中心研究员，北京大学前沿交叉学科研究院副院长。课题组主要从事化学生物学相关研究，结合运用化学探针、生物质谱和理论计算发掘和鉴定生物活性分子在细胞内的分子靶标和修饰位点。2013年入职北京大学以来，先后获得国家青千(2014)、国家杰出青年科学基金(2019)等项目的支持；获得“国际化学生物学学会青年化学生物学家奖”，“药明康德生命化学研究学者奖”等。以通讯作者身份在 Nature 、Nature Methods、Nature Chemical Biology 、JACS 、Angew 和 PNAS 等杂志发表论文 40 余篇。