推荐一篇发表在Cell Chem Biol上的论文，题目为“TK216 targets microtubules in Ewing sarcoma cells”，通讯作者是来自得克萨斯大学西南医学中心的David G. McFadden教授，他的研究方向是利用基因工程和化学筛选等技术来发现癌症的新疗法。
尤文氏肉瘤（EWS）是一种儿科恶性肿瘤，由染色体易位形成的 EWSR1-FLI1 融合蛋白驱动。TK216 被开发为EWSR1-FLI1 的小分子抑制剂，目前正处于与长春新碱联合治疗EWS的II期临床试验中。然而，TK216 对不表达 EWSR1-FLI1 的肿瘤细胞系仍然表现出抗癌活性，并且细胞毒性的潜在机制仍未阐明。这篇论文主要是利用了一个正向遗传学筛选平台来发现TK216耐药等位基因，这些耐药基因的突变可以揭示细胞毒性小分子的直接蛋白质靶标，进一步通过化学探针的竞争分析揭示TK216与蛋白靶标的结合机制。
作者使用 DNA错配修复缺陷型（MMR）A673 EWS 细胞对 TK216 进行了正向遗传学筛选，经过选择后出现了六个抗性克隆 (TK216 A-F)。首先作者证实了对 TK216 的抗性（IC50增大为原来的 1.98 至 2.74 倍）。然后作者通过测序在TK216抗性克隆中发现了重复突变的基因及其位点。TUBA1B和BRWD3两个基因在六个克隆中的四个中发生了突变。其中，TUBA1B基因编码的微管蛋白可能作为TK216的相互作用靶点吸引了作者的研究兴趣，因此作者使用CRISPR-CAS9技术将TUBA1B的突变导入到A673EWS细胞，进一步来测定TUBA1B D47和G142突变对TK216的耐药性的影响，结果显示TUBA1B D47或G142突变足以使人对TK216产生抗性。
因此作者推测TK216可能是微管（MT）的破坏因子，G142和D47突变通过稳定MT诱导了对TK216的抗性。接下来作者首先通过体外实验证明TK216延缓了MT聚合。此外作者还对TK216分离了对映异构体，只有(-)-TK216具有延缓MT聚合的活性。接下来作者通过超分辨显微镜观察到TK216和阳性对照秋水仙碱处理的A673细胞MT断裂。然而TUBA1B的G142A 突变体通过稳定 MT抵消了TK216 和秋水仙碱的作用。
作者之前的工作报道了一种微管蛋白化学探针，该探针可以共价修饰微管蛋白秋水仙碱结合口袋中的Cys239。作者猜测TK216 和秋水仙碱可能作用于同一结合口袋，因此采用一种竞争策略研究TK216、结构类似物YK-4-279、纯化的手性异构体是否对Cys239存在共价相互作用。竞争实验的结果显示6.3 mM 的TK216和1.6 mM 的(-)-TK216 表现出明显的竞争，因此确定了TK216与蛋白靶点相互作用的模式与位点。
总之，本篇论文通过正向遗传学筛选与化学探针竞争相结合的方法确定了TK216抗肿瘤机制。
本文作者：ZJ
责任编辑：LDY
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2451945622002343#!
文章引用：DOI: 10.1016/j.chembiol.2022.06.002
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