推荐一篇发表在Nature Methods的文章，本文的通讯作者是来自Scripps研究所的Cravatt教授。他们课题组研究的主要方向是开发功能性的化学蛋白质组学分析策略。另外一位通讯作者是他们组的研究生Esther K. Kemper。
通过蛋白质组学研究发现，人类的2万个基因会产生更多数量的蛋白质或者是蛋白质的功能形式。这些蛋白的功能形式很大程度上是通过翻译后修饰实现多样化的。而这些翻译后修饰如何影响蛋白质的结构和功能，需要高通量的在蛋白质组学维度进行研究，但是目前从整体上研究翻译后修饰对蛋白质功能的影响还具有很大的挑战性。一种有效的策略是自上而下的蛋白质组学方法，它可以独立分析单个蛋白质形态。虽然这一方法在最近取得了不错的进展，但是研究大分子量的蛋白质仍然是一个挑战，特别是在复杂的生物体系中。而自下而上的蛋白质组学研究则只能分析单一的整体信号的结果。本文作者开发了一种新的功能蛋白质组学策略，他们定量的将丝氨酸/苏氨酸磷酸化与半胱氨酸残基的反应性的变化联系起来。有丝分裂是一种重要的生物过程，维持正常的细胞周期需要通过一个复杂的翻译后修饰网络在时间分辨尺度上进行控制。其中磷酸化修饰就发挥着重要作用。研究发现有超过30,000个不同的有丝分裂磷酸化位点，其中20%仅存在于有丝分裂过程中。虽然目前已经有很多种蛋白质组学方法揭示了有丝分裂过程中蛋白质的修饰、结构以及定位的显著变化，但是不清楚的是，这些有丝分裂或者磷酸化修饰的蛋白质状态与这些蛋白的化学性质之间有什么联系。作者首先对有丝分裂细胞中半胱氨酸组的反应性基线进行了广谱的分析。作者通过经典的胸腺嘧啶-诺克达唑手段将Hela细胞的分裂周期同步化，然后用TMT-ABPP的方法分析每个细胞周期状态下半胱氨酸组的反应性。实验发现3000个半胱氨酸在有丝分裂过程中有超出两倍的反应性变化。在之前的报道中提到，有丝分裂中的活性氧会增加，但是实验发现例如像GAPDH C152以及PARK7 106这些对活性氧敏感的半胱氨酸并没有在实验中发生明显的变化。
随后作者开始研究磷酸化修饰依赖性的半胱氨酸反应性变化。因为丝氨酸/苏氨酸磷酸化会在有丝分裂过程中发生整体性的增加，所以作者着重对这两种氨基酸的磷酸化进行分析。作者首先通过实验证实用lambda磷酸酶（LPP）可以有效的调控细胞内的磷酸化水平，并且该过程不影响蛋白质组水平的整体变化。作者用优化好的这一实验方案对全面分析基于磷酸化修饰依赖的半胱氨酸组反应性的实验进行了设计，即对两组蛋白质组分别用或不用LPP处理后分别用IA-DTB对半胱氨酸进行标记，随后富集、定量、检测低磷酸化水平下以及正常磷酸化水平下半胱氨酸的活性差异。实验发现约1000个蛋白的半胱氨酸在蛋白去磷酸化后表现出明显的活性变化。在LPP的处理下引起的同步化或非同步化细胞下的半胱氨酸的反应性也发生了较大的变化。通过比较同一蛋白不同半胱氨酸在不同组中的变化，作者发现有丝分裂细胞蛋白质组中的半胱氨酸的反应性是依赖于磷酸化修饰的水平的。
随后，作者注意到在胰蛋白酶的肽段中有大量的含有标记的半胱氨酸肽段被富集，该肽段的丰度过高会导致其他目标被鉴定的机会变少。所以作者对实验流程进行了改进，首先将实验组用LPP处理，对照组不做处理。随后用IA-DTB探针标记半胱氨酸并进行富集。随后两个样品再次用LPP进行去磷酸化，用胰蛋白酶消化蛋白质，对样品进行上机处理和分析。该手段会改进两个方面，首先去除了在人工操作中导致的半胱氨酸反应活性的变化，其次在肽段经过富集后再进行酶切使得胰蛋白酶的肽段不会被富集。
通过生物信息学以及生物学的分析，作者发现被富集到半胱氨酸反应性有变化的蛋白大多与有丝分裂的过程相关。高丰度的磷酸化修饰经常发生在蛋白质内部的紊乱区域。实验发现，只有约5%的半胱氨酸显示出磷酸化依赖的反应性增加在紊乱区域。这些结果表明了磷酸化更有可能增加蛋白质结构区域内的半胱氨酸的亲和性。总之，本篇文章建立有丝分裂细胞中磷酸化修饰与蛋白质半胱氨酸反应性的联系。这些结果为研究磷酸化蛋白质组学与半胱氨酸依赖的共价药物的开发提供了良好的数据支持。
本文作者：WYK
责任编辑：MYZ
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-022-01398-2
文章引用：https://doi.org/10.1038/s41592-022-01398-2
目前评论：