分享一篇发表在Angew上的文章“Inhibition of autophagy by a small molecule through covalent modificationof LC3”。本文的通讯作者是中科院上海药物研究所的罗成研究员、复旦大学的党永军教授、中科院上海药物研究所的蒋华良院士和中科院上海药物研究所的周兵研究员。

      罗成课题组针对重大疾病相关通路、靶标，运用药物设计技术，开展基于药物化学生物学的靶标新功能发现、药物作用机理研究和创新药物研发。党永军课题组致力于天然产物和药物的分子靶点鉴定和作用机制研究，以及小分子化合物特异性的靶向蛋白用于基础生物学的理论研究。蒋华良课题组致力药学基础研究和新药研发，通过生物学、化学和计算科学等多学科的交叉，开展原创药物研究新策略与新方法、先导化合物发现和优化、药物靶标调控机制等研究。周兵课题组主要研究方向为药物化学，通过运用计算机辅助药物设计、化学生物学、药物化学等多学科交叉手段，开展基于表观遗传修饰酶和蛋白-蛋白相互作用的相关创新药物研发。

      自噬是真核细胞通过溶酶体降解去除可有可无或有毒细胞质的动态过程。一些疾病，如癌症、代谢性疾病、免疫紊乱和神经退行性疾病，都与自噬紊乱有关。自噬泛素样蛋白LC3是通过与包括自噬受体在内的其他自噬蛋白的LC3相互作用区(LIR)相互作用而发挥作用的，是一种很有前景的通过蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)来干预自噬的靶点。翻译后修饰，如乙酰化LIR相互作用表面的Lys49可能会破坏相互作用，为设计干扰界面的共价小分子提供了机会。本篇文章中，作者通过筛选共价化合物，发现了一种LC3A/B小分子共价抑制分子DC-LC3in，共价修饰LC3A/B蛋白Lys49位点。

      LC3B上Lys49和Lys51的乙酰化可能会引起空间位阻，阻止LC3B与其LIR-containing伙伴结合。为此，作者将LC3B晶体结构与其他LC3B-LIR多肽复合物结构进行了比对，比对结果显示Lys49和Lys51位于LIR相互作用面附近。因此，这些氨基酸侧链上的化学修饰可能会阻止LIRLC3相互作用。为了检测共价探针是否能与这些赖氨酸残基反应，LC3B中所有赖氨酸残基的pKa作为它们反应活性的指示剂，因为作为亲核试剂的赖氨酸残基应该有一个低的pKa值来支持与共价探针的亲核反应。在LC3B中的9个赖氨酸残基中，Lys49的pKa值最低，说明该残基的活性最强。因此，特别通过筛选修饰赖氨酸残基的共价探针来靶向LC3B LIR相互作用表面的Lys49是合理的。

      作者首先基于共价探针库的高通量筛选识别出LC3共价结合小分子。从PDB (Protein Data Bank)数据库和商业化合物库中收集共价warhead结构，然后进行了相似性搜索以探索不同的共价探针。最终获得约2000个具有潜在共价warhead的探针，用于构建内部共价探针库。在作者建立的基于荧光偏振(FP)的高通量筛选实验中，最终产生了7个IC50值小于50μM的化合物，其中DC-LC3in阻断了LC3B-LBP2的相互作用，IC50为3.06μM。

      接下来，作者利用蛋白热稳定性分析及核磁等方法确定DC-LC3in能够与LC3强结合，并使用质谱对修饰的共价键进行确认。通过MS/MS分析发现，当DC-LC3in与LC3B孵育时，LC3B的Lys49位点出现共价修饰，而不是Lys51位点。此外，DC-LC3in能够共价修饰HeLa细胞中过表达EGFP-LC3B的Lys49位点。

      为了验证详细的LC3B-inhibitor相互作用并帮助优化更有效的探针，作者解析了LC3B与DC-LC3in模拟物复合物的晶体结构，分辨率1.6Å。基于该结构对DC-LC3in进行进一步优化，获得了具有更强抑制效果的DC-LC3in-D5，IC50为0.20μM。基于活性蛋白分析(ABPP)的评估显示，衍生分子DC-LC3in-D5在HeLa细胞中对LC3A/B表现出强大的共价反应性和选择性。另外，作者还证明了DC-LC3in-D5在体外和HeLa细胞中抑制LC3B脂化，导致自噬结构的形成和自噬底物的降解不足，可以作为自噬研究和治疗干预的有力工具。

本文作者：WQW

责任编辑：Guo ZH

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202109464

文章引用：DOI：10.1002/anie.202109464