分享一篇发表在JACS上的文章：A New Chemoenzymatic Semisynthetic Approach Provides Insight into the Role of Phosphorylation beyond Exon1 of Huntingtin and Reveals N-Terminal Fragment Length-Dependent Distinct Mechanisms of Aggregation，通讯作者是来自洛桑联邦理工学院（EPFL）的Hilal A. Lashuel教授。Lashuel教授实验室应用多学科方法研究蛋白质错误折叠和聚集的分子和结构基础，以及这些过程对神经退行性疾病发病的影响。
亨廷顿蛋白Htt的N端结构域中聚谷氨酰胺重复序列扩增会导致蛋白聚集、引起亨廷顿病。大多数对Htt N端聚集机制的研究集中在Httex1区域上，并已知Httex1上的翻译后修饰以及之外的多个磷酸化位点能够调节蛋白的聚集并影响发病。目前对Httex1之外磷酸化的研究多使用点突变进行，而通过化学酶法进行的磷酸化功能研究仅局限在Httex1区域内。为了更好研究Httex1以外区域磷酸化对Htt结构及聚集的影响，本文作者们设计了新的化学酶法合成，在更长的Htt171 N端片段上特定的位置引入磷酸化修饰，并用这些修饰片段研究了Httex1以外的结构对Htt蛋白聚集的作用。
在蛋白合成部分中，他们首先通过两片段链接的方法实现了Htt171-23Q野生型/43Q突变型的半合成，并证明了这些合成肽能够和重组表达肽一样折叠成正确构象。而为了在Htt105–171区域内的特定位点进行磷酸化，他们对88种激酶进行筛选，得到了能够分别在T107、S116处特异性磷酸化Htt的激酶TTBK1、MLK3，以及能同时磷酸化两个位点的MST3；之后在体外使用这些激酶对Htt105–171片段进行处理，最后连接得到了位点特异性磷酸化的Htt171-23/43Q蛋白，并通过位点特异性磷酸化抗体、UPLC和ESI-MS进行了验证。
接下来使用ThS测定蛋白的聚集动力学、用CD分析研究蛋白的二级结构。首先发现对于两种polyQ突变型，Htt171-43Q表现出比Httex1 1-43Q慢的聚集动力学，证明Httex1以外的结构域比如96-171的富含螺旋区域在调节N端聚集体形成及形态上的作用；此外，发现T107和S116的磷酸化状态都不会引起野生型Htt171-23Q的聚集，而T107磷酸化会导致突变型Htt171-43Q的聚集明显滞后约4小时，此时T107磷酸化没有影响蛋白的螺旋构象或者蛋白寡聚体的状态。这些结果说明polyQ仍是Htt171聚集的驱动因素，但是105-171区域磷酸化会调节动力学及聚集途径；而进一步对105-171结构的研究提示T107磷酸化会导致螺旋度降低，可能因此导致Htt171寡聚化。最后，他们具体研究了Httex1和H171-43Q之间聚集机制的差别，并基于时间依赖性 EM 和 AFM 分析结果，提出了一种聚集机制：相分离驱动了单体聚集形成各种尺寸的低聚物，进一步聚集后作为引发原纤维生长的成核位点，多个成核位点生长的原纤维表现出高度的自结合倾向，最后形成紧密堆积的原纤维组件团块；而Htt171-43Q中的C端结构域（105-140）在调节聚集过程中的早期事件中起了重要作用。
总之，本文通过新的化学酶法策略合成了带有位点特异性磷酸化的较长Htt N端片段，并发现了Httex1以外的磷酸化以及C端结构域会对Htt N端聚集产生影响。这也提示可以针对Httex1以外的结构来进行对Htt 聚集的调控及对Htt聚集抑制剂的筛选。
本文作者：MYZ
责任编辑：LDY
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c03108
原文引用：DOI：10.1021/jacs.1c03108
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