为大家分享一篇发表在Nature Cell Biology上的文章Defining E3 ligase–substrate relationships through multiplex CRISPR screening，通讯作者是哈佛医学院的Stephen J. Elledge，他们课题组的研究方向是病原宿主相互作用及E3 ligase相关的生物通路。
泛素-蛋白酶体系统的特异性主要依赖E3泛素连接酶来实现，但对于许多E3 ligase来说，它们的底物降解子（degrons）分子特征在很大程度上仍然未知。本文中作者基于多重CRISPR筛选平台鉴定了Cul1FBXO38/Cul2APPBP2/Cul3GAN/Cul3KLHL8/Cul3KLHL9/13/Cul3KLHL15的底物，对于高通量筛选E3连接酶-底物相互作用组具有重要意义。
本文的工作基于通讯作者于2018年发表的工作，在该工作中，作者通过慢病毒平台将短肽或全长开放阅读框（open reading frames，ORFs）与绿色荧光蛋白（GFP）融合在一起，并同时表达DsRed作为内参荧光来归一化表达水平，通过给予抑制剂或不同的sgRNA来影响目标E3 ligase的催化能力，最后通过FACS筛选读出GFP/DsRed比率读出融合伴侣对GFP2稳定性的影响，这种方法称为全局蛋白稳定性筛选方法（Global Protein Stability，GPS）。但这种方法的每次筛选只能检测一种底物，因此限制了其规模，所以在本文中，作者将筛选的sgRNA组融合进GFP底物载体中，将功能丧失CRISPR筛选和GPS结合起来。在绝大部分细胞中，sgRNA靶向不相关的E3 ligase，因此不影响GFP融合蛋白的稳定性。然而在少数细胞中，sgRNA会破坏同源的E3 ligase，导致融合蛋白的稳定性增加，GFP荧光增强。最后通过FACS就可以将这部分细胞分选出来测序得到对应的GFP融合底物和sgRNA靶向的E3 ligase。
在构建好这一体系后，作者通过对分选的细胞测序验证了此前发现的E3 ligase特异性，例如KLHDC2被确定为11种肽的特异性识别酶，其中6种肽的C端以GG结尾，为经典的KLHDC2-degron，之后作者发现了大量FEM1B靶向底物，这种E3 ligase此前没有明确报道其degron，而在作者的数据种大部分FEM1B靶向的肽段C端以脯氨酸结尾。作者进一步使用结构预测手段和生化实验验证了这种特异性的结构基础。 总之，本文发展了一种基于多重CRISPR筛选的高通量鉴定E3 ligase-degron相互作用的方法，并探索了目前未知的E3 ligase底物的特异性特征，在E3 ligase相关疾病和药物开发上具有重要意义。 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41556-023-01229-2
文章引用：10.1038/s41556-023-01229-2
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