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推荐一篇发表在Adv. Sci.上的文章，文章标题是FluoMALDI Microscopy: Matrix Co-Crystallization Simultaneously Enhances Fluorescence and MALDI Imaging。其通讯作者是约翰·霍普金斯大学医学院的Kristine Glunde教授。课题组工作主要是使用分子生物学、细胞生物学和多尺度分子成像方法来研究和可视化驱动癌症生长、侵袭和转移的分子事件。
质谱成像（MSI）通过分子量直接识别和可视化各种生物分子在组织切片、细胞和其他复杂环境中的分布。MSI无需特定标记或了解组织的生化成分即可实现多重成像，已发展成为重要的分子发现工具。目前，基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱成像是生物医学和临床研究中最常用的MSI工具。 荧光成像作为最广泛用于临床研究的成像技术，与MALDI成像结合，可以显示更详细的解剖学、形态学和细胞结构信息。目前两种技术结合的工作流程是在MALDI成像前进行自发荧光成像，需要正确共配准MALDI成像数据和荧光成像数据，这一过程通常非常耗时，并且需要专门的自制软件。 此前，作者发现MALDI基质与荧光基团的共结晶可以显着提高自发荧光成像的强度。因此，在这项研究中，作者提出了FluoMALDI方法，集成了自发荧光成像和MALDI质谱成像，同时提供增强的荧光强度和来自同一组织切片的分子信息，克服了当前两种成像方法结合时的技术问题和局限性。 FluoMALDI成像流程如图1所示。首先，在氧化铟锡（ITO）载玻片上放置生物样品的冷冻切片。然后，将所选的MALDI基质沉积在样品上，以获得所需厚度的基质涂层。接着，用荧光显微镜在所需波长下进行荧光成像。最后，在同一载玻片上采集MALDI成像数据。 图1. FluoMALDI成像的流程。 MALDI基质增强荧光基团的荧光信号强度 首先，为了测试FluoMALDI中MALDI基质覆盖增强的荧光强度，作者在ITO载玻片上用含有荧光团的记号笔画出一个“J”形状的标记，然后使用1,5-二氨基萘（DAN）、9-氨基吖啶（9AA）、2,5-二羟基苯甲酸（DHB）、芥子酸（SA）、去甲哈尔满（nH）和ɑ-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）这六种常见MALDI基质进行喷涂。结果显示，单独使用溶剂喷涂对荧光信号强度没有任何影响，而所有测试的MALDI基质涂层都导致荧光信号显著增强，其中nH和CHCA的增强最大（图2B和2C）。 同时，为了确定喷涂的基质密度（即喷涂的基质层数）是否影响荧光信号强度，作者在载玻片上用记号笔画出水平线，分别施加了0 μg/mm2（0x）至1.6 μg/mm2（24x）的CHCA基质，然后进行荧光成像（图2D）。结果表明，产生的荧光信号强度随基质密度线性增加（图2E）。 此外，为了测试其他荧光基团是否也有荧光增强现象，作者在载玻片上施加了四种常用外源性荧光团（荧光素，Alexa Fluor 488，罗丹明B和Alexa Flour 555），然后覆盖1.6μg/mm2的CHCA。结果如图2F所示，与未覆盖基质的对照斑点相比，所有覆盖CHCA的荧光团斑点的荧光信号强度显著增加，其中罗丹明B和Alexa Flour 555显示出最高的信号强度（图2H）。 最后，作者研究了基质是否会对内源性荧光团（黄素腺嘌呤二核苷酸，FAD和原卟啉IX，PPIX）产生影响，这两种物质在细胞中普遍存在，并且对组织自发荧光信号有显着贡献。结果如图2G所示，与外源荧光团类似，基质覆盖也显着增加了内源荧光团的信号强度（图2I和K）。 图2. MALDI基质涂层可增强荧光基团的荧光强度。 MALDI基质增强组织切片的自发荧光信号强度 由于FluoMALDI使内源性荧光团的荧光强度增强，作者研究了MALDI基质覆盖是否会增强组织自发荧光的信号强度。作者以小鼠脑组织切片为研究对象，在基质覆盖之前，检测绿色和红色三种颜色的自发荧光，其中绿色荧光的自发荧光强度最高。随后，作者将脑组织切片的一半用铝箔遮挡，再喷洒基质，从而直接在同一样品上比较基质涂层区域和未涂层区域。结果显示，与未覆盖基质的对照相比，所有覆盖基质的区域荧光强度显著增强，并且具有自发荧光信号的解剖特异性（图3A和3B）。 此外，作者研究了基质密度与组织自发荧光强度之间的相关性。以CHCA为基质，将涂层密度从0 μg/mm2（0x）增加至2.2 μg/mm2（32x），观察到荧光强度的显著增强，组织完整性和自发荧光的特异性也能够保留（图3C和D）。 图3. 小鼠脑组织切片的MALDI基质覆盖增加了自发荧光强度。 荧光基团与MALDI基质的共结晶增加其荧光强度
随后，作者进一步研究MALDI基质与荧光基团共结晶增强荧光基团强度这一现象。作者首先对基质单独形成的晶体和荧光基团存在下基质形成的晶体进行研究，在40倍镜下比较了其在结构差异，清楚地观察到罗丹明染料被掺入基质晶体中，将其染成红色，并使晶体结构发生明显变化（图4A）。同时，作者将等体积的基质溶液和荧光团溶液混合，并实时记录共结晶过程（图4B-D）。当只有CHCA基质时，晶体以不规则的形状生长，荧光强度也在几秒钟内迅速增加。当加入荧光基团后，共晶体也可以在几秒钟内快速生长，晶体周围溶液的荧光强度随着晶体生长而降低，表明在共晶形成过程中，周围液体的荧光基团逐渐耗尽。
图4. 荧光基团与基质的共结晶。
此外，作者进行了单晶X射线晶体学，如图5所示，清楚地显示出了CHCA和罗丹明B的共结晶，两者之间发生交错的π-π堆积相互作用，与其他分子增加量子产率和荧光强度的研究一致。
图5. CHCA-罗丹明B共晶的单晶X射线晶体学。 基于激光扫描共聚焦显微镜的FluoMALDI方法
接下来，作者使用共聚焦荧光显微镜，依次使用不同波长的激发光在小鼠脑组织切片上采集荧光光谱成像，在415 nm至 690 nm内进行检测。结果如图6显示，与未覆盖基质的部分相比，覆盖基质的部分具有显着的荧光增强，其中488 nm和514 nm的激发，对荧光的增强最为显著（图6B）。然后，在同一组织切片上以5 μm的空间分辨率进行MALDI成像，以代谢物，肽和脂质的分子分布来显示海马角的解剖结构和形态（图6D）。在MALDI成像后，再进行H&E染色并彩色成像，以得到分析的海马角的解剖结构（图6A）。
图6. 在鼠脑组织切片上使用共聚焦显微镜成像和MALDI成像。 荧光扫描对MALDI成像的影响
为了评估荧光扫描是否会对MALDI成像产生影响，作者以小鼠脑组织切片为研究对象，在荧光成像时用铝箔将其右半区域遮挡。结果如图7所示，质谱数据和特定m/z的成像结果表明单次荧光扫描不会影响MALDI成像的质谱信号强度和成像质量。
图7. 荧光扫描对MALDI成像的影响。 在这项工作中，作者开发了一种新的成像方法——FluoMALDI成像，实现同一组织切片的自发荧光成像和MALDI成像，通过荧光基团与MALDI基质的共结晶来显着增强荧光强度。FluoMALDI方法得到的荧光成像结果和MALDI成像结果，是从同一样品中收集的，因此将其组合起来只需要线性配准，大大简化了本需要复杂算法的配准过程。 文章作者：CXY DOI：10.1002/advs.202304343 责任编辑：LD
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