分享一篇2023年发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章,题目是“A Fluorescent Probe for Investigating the Role of Biothiols in Signaling Pathways Associated with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury”。文章的通讯作者为山西大学的阴彩霞教授和高丽大学的Jong Seung Kim教授。中风是一种急性脑血管疾病,是人类三大致命疾病之一,其特点是发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高。目前,再灌注是逆转缺血性中风后脑损伤的重要措施,但治疗可能会造成继发性细胞和组织损伤,称为脑缺血再灌注损伤(CIRI)。作为生物体中重要的抗氧化剂,生物硫醇对于研究 CIRI 和其他神经退行性疾病发病机制中的氧化应激至关重要。近年来,近红外荧光探针已被应用于体外和体内监测生物硫醇。鉴于大脑的复杂结构,开发小分子穿过血脑屏障(BBB)极具挑战性。基于该背景,作者开发了一种跨 BBB 的激活的、高选择性的近红外荧光探针来监测大脑中的生物硫醇。
图1 a) 生物硫醇介导的NF-κB 信号通路调节氧化应激和 b) 用于感测生物硫醇的小分子近红外 (NIR) 发射染料的设计策略的示意图。
作者设计并构建了一种新型探针DCI-Ac-Py来实时监测大脑中的生物硫醇(方案 1A)。选择吡啶酸酯作为识别基团,异氟酮衍生物作为荧光母体,引入卤素原子和吡啶酸酯,增加荧光团的发射波长并缩短生物硫醇和吡啶酸酯之间的反应时间。当生物硫醇攻击DCI-Ac-Py的吡啶酸酯时,酯基断裂,释放出氧阴离子,进一步攻击缺电的碳原子,发生分子内成环,从而生成DCI-Br-Cou大共轭度和优异的光学性质,实现生物硫醇的实时检测。
图2 在pH 7.4 PBS 缓冲液(10 mM,45 % DMSO,v/v)中添加各种潜在分析物(100 μM)后,DCI -Ac-Py (20 μM)的a)吸收和(b)荧光强度(λ ex = 541)nm,狭缝/狭缝=6/4 nm)。插图光谱显示添加各种物质后DCI-Ac-Py的荧光发射。c) DCI-Ac-Py对生物硫醇的反应动力学。d)在 pH 7.4 PBS 缓冲液(10 mM,45% DMSO,v/v)中存在Cys(10 当量)的情况下,DCI-Ac-Py的归一化吸收和荧光光谱。e) pH值3-11范围内Cys检测过程中pH值的影响。f, g) DCI-Ac-Py (20 μM) 对 Cys (0–20 μM)的滴定谱。h, i) DCI-Ac-Py的荧光强度图(20 μM) 在 713 nm 与不同浓度的 Cys (0–18 μM)。误差范围代表标准偏差(SD) ( n = 3)。
作者首先进行了体外测试。为了测试DCI-Ac-Py的有效性,研究了其光谱特性。 DCI-Ac-Py可以高选择性地检测生物硫醇(图 2a和2b)。同时, DCI-Ac-Py的荧光动力学表明,荧光强度分别显着增强65、57 和 49 倍(图 2c )。此外, DCI-Ac-Py和生物硫醇之间的反应产物DCI-Br-Cou具有大的斯托克斯位移,这对于生物成像非常有益(图 2d)。研究了DCI-Ac-Py对生物硫醇的 pH 依赖性。如图2e所示 ,DCI-Ac-Py稳定,并且在3至10的宽pH范围内发射恒定,表明DCI-Ac-Py可用于生物硫醇的生物检测。为了进一步研究DCI-Ac-Py与生物硫醇的相互作用,进行了DCI-Ac-Py的滴定实验进行了生物硫醇的转化(图 2f、 2g),检测限分别为 27、55 和 74 nM(图 2h 和2i )。
图3 HT22 和PC12 细胞中生物硫醇的共焦激光扫描显微镜图像。(a)用不同浓度的DCI-Ac-Py (0、5、10、15 或20 μM)处理的 HT22 和 PC12 细胞的荧光图像,DAPI 和DCI-Ac-Py (10 μM)的荧光响应(b) HT22 和(c) PC12 细胞。使用DCI-Ac-Py的HT22 和 PC12 细胞中(d) 浓度依赖性和 (e) 时间依赖性荧光信号的相对荧光强度(λ ex = 561 nm,λ em = 640–745 nm,比例尺:10 μm )。误差范围表示 SD ( n = 3)。
受DCI-Ac-Py对生物硫醇优异荧光响应的启发,进一步研究了DCI-Ac-Py对活细胞中生物硫醇的成像。用不同浓度的DCI-Ac-Py处理PC12和HT22细胞,观察到明显的荧光(图 3a和3d)。此外,还研究了DCI-Ac-Py细胞内生物硫醇成像的动力学,表明DCI-Ac-Py可用于快速检测细胞内生物硫醇(图 3b、 3c和3e)。随后,作者还使用HT22细胞通过建立氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟了缺血过程,证明了细胞氧化应激的发生。并采用免疫荧光染色进一步分析相关NF-κB信号通路中P65和RelB相关蛋白的表达情况。结果表明,EDA作为一种脑保护药物,可以清除自由基,抑制神经细胞的氧化损伤,缩小脑梗塞面积,从而有效治疗CIRI。这些结果与细胞水平的检测结果一致,表明CIRI的发生与NF-κB的经典和非经典激活途径有关,为研究氧化损伤相关疾病的修复机制提供了参考。综上,本文中作者通过合理的分子设计策略构建了一种新型近红外(NIR)荧光探针,用于穿越血脑屏障,且研究表明DCI-Ac-Py是研究脑神经系统中与生物硫醇相关的生物学机制和信号通路的优异荧光探针。
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