给大家分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的研究进展，题为： Assessing Squarates as Amine-Reactive Probes。该工作的通讯作者是来自麻省理工大学的Laura L. Kiessling。 共价蛋白修饰可以用来了解蛋白质的结构和功能，识别新的配体，并确定配体的结合位点。许多蛋白质缺乏有效的小分子配体，这促使人们寻找能够将配体转化为共价探针的官能团。亲电试剂与半胱氨酸的反应通常用于探针中。然而许多靶蛋白缺乏暴露的半胱氨酸并且许多半胱氨酸残基参与了二硫键。赖氨酸在蛋白质中的含量是半胱氨酸的三倍多，通常位于活性位点附近或蛋白-蛋白相互作用位点。然而，赖氨酸残基的普遍存在对反应速率和选择性之间的平衡提出了更高的要求。 方酸衍生物（方酸酯）是一种小的亲电试剂，其特征是一个环丁烯二酮和两个烯基酯。其优先与胺亲核试剂反应，而不是醇或硫醇。此外，方酸衍生物可以与两种不同的胺亲核试剂反应。第一步可产生方酰胺酯，其亲电性低于其前体。这种物质可以与另一个胺反应生成不对称的双方酰胺产物。这一特性已被用于构建对映选择性有机催化剂，合成蛋白-聚糖偶联物等。 作者认为具有弱亲电性的方酰胺可成为优秀的共价探针:方酸酯/酰胺在复杂的生物混合物中是稳定的。作者进一步可以调整方酸衍生物的结构，平衡反应性和选择性，使其成为有效的共价探针。 因此，作者合成了一系列具有不同电子特性的方酰胺酯。作者将它们的反应动力学与其他通常用于生物偶联的亲氨试剂(琥珀酰亚胺酯和二氯三嗪)进行了对比，方酰胺酯的反应性比琥珀酰亚胺酯低约100倍，并且可以通过取代基调整。作者通过计算分析模拟了方酸衍生物反应活性的变化。 作者的研究表明，即使是中等亲和力的配体，方酸衍生物依然可用于亲和标记。作者生成了一种含有方酸的尿苷二磷酸(UDP)衍生物，并发现它可以选择性地修饰分枝杆菌酶半乳糖呋喃基转移酶2 (GlfT2)，该酶具有21个表面赖氨酸。尽管UDP部分是一个低亲和力抑制剂(Kd在mM级)，方酰胺依然具有共价抑制作用。随后的分析显示，在结合位点附近有一个赖氨酸被修饰。结果也表明，方酸衍生物比相应的二氯三嗪特异性更高。 作者首先评估了方酸衍生物的反应活性（图1）。结果表明胺的第二次取代活性相比第一次会降低很多，并且两者均远小于活化酯的胺解反应。接着作者探究了取代基效应，通过改变苯胺上的取代基，改变方酸衍生物的反应活性。Hammett图显示了反应性与取代常数σ之间的线性关系，吸电子基团会使反应速率增大（图2）。总体来看，取代基对于反应活性的影响较小。作者随后也探究了不同结构的酯以及将O换为S后取代活性的变化。实验结果和计算均表明硫酯的反应活性更高，并且易直接生成双酰胺取代产物。图2. 取代基效应（Hammett plot曲线） 接着作者探究了方酸介导的共价靶向GlfT2。GlfT2是一种缺乏紧密结合配体的底物，它是结核杆菌中的一种必需酶，可催化呋喃半乳糖残基生成半乳糖。底物尿苷二磷酸半乳糖呋喃糖(UDP- Galf)的表观Km为0.4 mM。UDP衍生物可以结合和抑制GlfT2，其Kd值与底物Km相似。作者合成了UDP-方酸衍生物12（图3A），以确定它是否会选择性地反应，以及共价连接是否会改善UDP的抑制作用。质谱(MS)数据表明，该蛋白主要在单个位点被12标记。赖氨酸共价修饰的GlfT2模型B)12组; C)13组 为了将12与活性更强的亲电试剂进行比较，作者合成了UDP衍生物13，并对标记了10倍浓度的12或13的样品进行了蛋白质组学分析。在这些条件下，12仍然是选择性的(图3B)，而二氯三嗪13与8个赖氨酸残基反应，位点分散在GlfT2的表面。 随后，作者用12处理GlfT2，持续时间不同，然后添加天然底物UDP-Galf和合成受体。GlfT2活性降低，表明受到了12的抑制。抑制程度与探针浓度和标记时间有关。作者还评估了连接子PEG长度的影响，较短的长度抑制作用较弱。最后，作者将12与非共价配体尿苷-单磷酸(UMP)进行了比较。两者处理GlfT2均可抑制80%的酶活，然而在透析后UMP组恢复酶活，12组酶活并未恢复，表明了酶活的抑制是由于共价修饰作用。图4. GlfT2酶活测试：A)不同处理时间和浓度; 综上，作者开发了一种方酸衍生物作为胺反应探针，它们的反应速度正好可以匹配反应性和选择性，即使是中等亲和力的配体，方酸衍生物依然可用于亲和标记。DOI: 10.1021/jacs.2c05691Link: https://doi.org/10.1021/jacs.2c05691
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