介绍一篇2022年4月发表在Nature Communication上的文章，文章的题目是：Cyclic 5-membered disulfides are not selective substrates of thioredoxin reductase, but are opened nonspecifically，通讯作者是慕尼黑路德维希-马克西米利安大学药学系Oliver Thorn-Seshold教授。

特定的二硫醇/二硫醚交换反应是生物学中许多关键途径的基础。通常主要以硫氧还蛋白还原酶-硫氧还蛋白（TrxR-Trx）系统和谷胱甘肽还原酶-谷胱甘肽-戊二蛋白（GR-GSH-Grx）为关键点，这些系统驱动数百种对细胞代谢至关重要的氧化还原反应。因此，TrxR/Trx有希望成为治疗的靶点，设计选择性探针或底物来报告其活性或靶向这些氧化还原节点，将在基础生物学和应用生物医学研究中实现广泛的应用。一个特别重要的环状二硫键是5元的1，2-二硫环（图1c）。该基序是关键细胞氧化还原辅因子硫辛酸的基础。相比之下，环状二硫化物表现出非常不同的巯基-二硫键交换或还原的动力学和热力学，可能具有不同的特异性。巩固了其作为氧化还原辅助因子的作用

将这些应变的二硫化物附着在分子货物上，从而大大提高了其细胞摄取率（图1d;）重要的是要注意，这一过程可能会受到硫醇反应性物质的强烈影响：硫醇反应性亲电试剂或氧化剂使细胞摄取率降低许多倍它们与细胞内氧化还原环境有很大的关系。荧光 TRFS 探针和前药已被广泛用于细胞研究、商业化和审查（图 1e）。在帕金森病中的作用。

二硫触发物只有在细胞环境中抵抗硫醇-二硫键交换产生的信号或细胞单硫醇背景（约50 mM，其中约5 mM GSH). 因此，通过用GSH进行SS50-PQ （10 μM）的无细胞孵育来测试选择性的潜力。我们观察到对亚生理GSH水平的强烈，快速的探针反应。引起半极大荧光的GSH浓度（“EC50高净值“）的≲1 mM（图3a;）。这表明即使不涉及酶催化，1，2-二硫代烷探针也可以通过细胞GSH浓度快速完全降低。筛选了其他单硫醇还原剂，例如半胱氨酸（Cys），N-乙酰半胱氨酸（NAC），N，N-二甲基半胱胺（MEDA）和半胱胺（CA），发现与GSH相比，具有相似浓度和动力学的快速探针活化（图3b）。这表明1，2-二硫代烷通常对单硫醇不稳定，因此衍生自它的探针将被细胞内硫醇背景迅速激活。该探针对非还原降解（例如氨解）完全稳定，突出了叔酚氨基甲酸酯的稳定性，并支持互换/还原是其信号生成途径。与TCEP基准相比，两种1，2-二硫代烷探针非特异性降低，Trx1、Trx2、TRP14、Grx1、Grx2和TrxR1均具有较高的转化率（图3c）。Trx系统和Grx偶联的GSH系统（TrxR/Trx和GR/GSH/Grx;图3d）对于两种1，2-二硫环戊烷基探针具有相同的活化曲线。

使用SS50-PQ报告1，2-二硫代环戊烷的性能，又测试了一些其他性能。在HeLa宫颈癌，A549肺癌，Jurkat T细胞淋巴瘤和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞系中应用了SS50-PQ。所有细胞系都迅速产生了明确的PQ-OH荧光。荧光定量显示信号几乎线性（图4a），浓度依赖性（图4b）增加，表明没有饱和效应起作用。PQ-OH的固体沉淀在细胞内定位并在大多数细胞中可见（图4c）。并且采用流式细胞术收集探针激活的单细胞分辨统计数据。因为固体PQ-OH沉淀在固定过程中被细胞保留，约>60%的细胞表现出强烈的PQ-OH荧光。作者在受精后用SS50-PQ在活落射荧光和共聚焦显微镜成像中孵育斑马鱼合子和胚胎长达3天（图4e）。这标志着我们报告的氧化还原探针设计对于将来与其他触发器的调整很有价值。

接着作者以对TrxR具有强依赖性的硒基硫醚RX1探针作为内参，用线性二硫醚SSOO-PQ测试了被激活后的TrxR中1，2-二硫代烷的活性。不补充硒培养的细胞不能将Sec完全掺入TrxR中，从而降低细胞TrxR活性. 然而，Na2SeO3 饥饿或补充对SS50-PQ或TRFS绿色信号没有显着影响（图5a）。调节TrxR活性的另一种方法是提供硫代磷酸盐，其促进半胱氨酸插入硒蛋白合成过程中编码的UGA密码子.同样，我们对SS50-PQ或TRFS-green信号时程没有影响（图5b）。这些结果反映了探针SS00-PQ的响应与TrxR的活性无关。接下来，更严格地评估了TrxR1依赖性，比较了TrxR1敲除MEF细胞系（TrxR1−/−)到其亲本细胞系）。敲除不影响来自SS50-PQ（或SS00-PQ）的信号，并且仅将TRFS-green的信号降低了约40%（图5c）这表明二硫代环探针确实不是细胞中TrxR活性的有效报告者。

关于探针的细胞TrxR选择性的文献声明在很大程度上依赖于抑制其细胞活化的化学抑制剂处理。我们首先测试了最近开发的TrxR抑制剂TRi-1和TRi-3.SS50-PQ或TRFS-green在与TRis预孵育的细胞中具有与未处理对照相似的信号：TrxR非依赖性SS00-PQ的行为特征，但与强烈抑制的基准RX1不同（图5d，e，）。因此，TrxR抑制和TrxR敲除都不会大大改变SS50-PQ或TRFS-green的细胞活化。结合显示一系列细胞硫醇对1，2-二硫代烷探针的快速和非特异性激活的无细胞结果，我们得出结论，1，2-二硫代烷探针的细胞激活不能有意义地报告TrxR活性。

1，2-二硫代烷探针和中间体存在浓度依赖性、非还原开环聚合（ROP）的影响，因为负责其荧光的ESIPT在没有酚类氢的情况下就无法发生：因此ROP不会触发SS50-PQ中可误解的信号生成。测试了Fast-TRFS，看看ROP是否可能起作用并导致对其性能的误解。Fast-TRFS是一种基于1，2-二硫环戊烷的探针，在还原时不会释放货物（图6a).由于过滤后的1，2-二硫醇烷的部分PET淬灭，Fast-TRFS具有较弱的荧光，在非极性介质中部分增强。其荧光还原产物二硫醇-TRFS没有PET猝灭（图6a），其荧光在非极性介质中再次强得多。我们认为小脂质/磷脂囊泡悬浮液是一种有用的无细胞模型，可以捕获不均匀细胞测定环境的某些方面，并测试环境敏感化合物的行为，而无需细胞还原剂的复杂性（图6b）。我们的第一个假设是疏水性Fast-TRFS可能从水性介质浓缩到高表面积的非极性环境中，从而启动其二硫烷的浓度依赖性，菌株促进的ROP，得到聚合物PolyLinear-TRFS（图6c）。后者利用类似于TRFS-green的物种的π堆积来提高1，2-二硫醇的局部浓度，从而引发聚合反应。第二个假设是，非应变ROP聚二硫化物产物PolyLinear-TRFS的荧光将模仿非应变单二硫类似物（如Linear-TRFS）的荧光（图6a）：它将比Fast-TRFS更具荧光，因为不再进行PET淬灭。线性TRFS也会随着脂质囊泡浓度的增加而增加荧光强度，直到达到所有线性TRFS被提取到脂质相的极限。然而，Fast-TRFS的荧光继续增加，其速度较慢，取决于脂质含量：与Fast-TRFS较慢的荧光寡聚一致，其中可用的脂质体积起着催化剂负载的作用。在短短一小时内，存在0.9%wt囊泡但没有还原剂的Fast-TRFS信号达到了与添加10当量TCEP建立的相同的荧光平台，令人高兴的是，这与将线性TRFS与0.9%wt囊泡混合后≤5分钟内看到的信号相同（图6d）。即在不均匀介质中快速TRFS经历非还原ROP到PolyLinear-TRFS，可以轻松达到最大理论荧光值。因此，在细胞或裂解物测定的非均质培养基环境中，Fast-TRFS 可能无法区分还原为二硫醇-TRFS、从硫醇-二硫醚交换到单硫醇产物，或从非还原性 ROP 到多线性-TRFS。基于1，2-二硫环戊烷的探针不应被解释为裂解物，细胞或体内任何特异性还原酶的选择性报告。

综上所述，要了解 1,2-二硫杂环戊烷的复杂行为，必须考虑探针定位、环境依赖性荧光、还原依赖性开环聚合和硫醇依赖性细胞摄取；联合应用嗜硫抑制剂时需要特别小心。作者提出了一种通用的可还原探针控制检测误读，以确保未来的TrxR靶向设计得到可靠的选择性评估，并更好地定位未来的研究。