分享一篇发表在 Angewandte Chemie International Edition 上的文章，题目为“An Efficient Opal-Suppressor Tryptophanyl Pair Creates New Routes for Simultaneously Incorporating up to Three Distinct Noncanonical

Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells”。在哺乳动物细胞中将多种不同的非天然氨基酸(ncAA)定点整合到蛋白质中是一项很有前途的技术，每个ncAA必须被分配到不同的正交氨酰-tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对，该对读取不同的无义密码子。可用的对抑制TGA或TAA密码子的效率比TAG低得多，限制了这项技术的范围。在这里，作者等人证明了大肠杆菌色氨酰(EcTrp)对在哺乳动物细胞中是一个很好的TGA抑制因子，它可以与其他三个已建立的对相结合，为双ncAA的掺入开发三条新的途径。利用这些平台，作者等人以极高的效率将两个不同的生物偶联手柄定点整合到抗体中，并随后用两个不同的细胞毒性有效载荷标记它。此外，作者等人将EcTrp对与其他对相结合，在哺乳动物细胞中将三个不同的ncAA特异性地整合到一个报告蛋白中。

目标ncAA被结合到蛋白质中，以响应无义或移码密码子，使用不与来自宿主细胞的对应物发生交叉反应的工程氨基酰合成酶(aaRS)/tRNA对。为了同时将多个不同的ncAA结合到一个蛋白质中，每个ncAA必须被分配到不同的aaRS/tRNA对，该对对译码不同的无义/移码密码子。这些不同的aaRS/tRNA对不仅应该与它们的宿主对应物正交，而且应该相互正交。

尽管一些可用的对是TAG无意义密码子的很好的抑制者，但在哺乳动物细胞中，最多两种不同的ncAA能够特异性地结合到蛋白质中：Pyl+EcTyr和Pyl+EcLeu，以及相互正交的Pyl对的组合。虽然这些可用的对是TAG无意义密码子的很好的抑制，但它们对TGA和TAA无义密码子的解码效率明显较差。发展新的相互正交的aaRS/tRNA对，能够有效地解码除TAG之外的无义密码子，将极大地扩大哺乳动物细胞中多ncAA突变技术的范围。

两个不同的ncAA的特定位点合并依赖于两个独特的“空白”密码子的使用。所有以前为ncAA在哺乳动物细胞中掺入而开发的AARS/tRNA对都是作为TAG抑制子开发的，这些对在抑制TAG方面明显比TGA或TAA更有效。

在本实验中，使用了以下合成酶和ncAA：带有Bock的M.barkeri PylRS，带有Omey的EcTyrRS，带有Cy5Az的EcLeuRS，和带有5HTP的EcTrpRS。

EcTrp对表现出的高TGA抑制效率使其成为在哺乳动物细胞中开发新的双ncAA突变平台的良好候选者，前提是它可以与另一对TAG抑制对同时使用，而不会发生交叉反应。为了探索这三对是否能与蛋白石抑制EcTrp对结合，使用了上述三质粒转染实验来检测潜在的交叉反应。每个aaRS与四个不同的TAG或抑制tRNA的TGA以及携带适当无意义密码子的EGFP报告蛋白质粒一起共转染。结果表明只有当每个AAR与其同源抑制因子tRNA结合时，才能观察到强劲的报告表达，无论是TAG还是TGA。唯一的例外是先前报道的EcTyrRS和tRNAEcLeu之间的交叉反应。这些观察表明，抑制TGA的EcTrp对没有与其他三个aaRS/tRNA对发生交叉反应，应该有可能将它们结合起来，为哺乳动物细胞中的双ncAA掺入开发多个新的平台。

将含有EcTyrTAG+EcTrpTGA、EcLeuTAG+EcTrpTGA或PylTAG+EcTrpTGA的质粒共转染HEK293T细胞，通过荧光检测检测报告基因的表达。令人满意的是，所有三个测试的双抑制系统在两个合适的ncAA底物存在下都显示了成功的报告表达。尽管在没有这两种ncAA底物的情况下，报告基因的表达显著减少，但当单独省略5HTP时，可以观察到明显的表达。这可能是由于工程的EcTrpRS突变体在没有其首选底物5HTP的情况下以低水平充电色氨酸的能力。还能够使用不同的ncAA组合显示双重抑制：EcTyrTAG+EcTrpTGA的Omey+5htp和AZF+5htp(图3B)；EcLeuTAG+EcTrpTGA的Cy5Az+5htp；PylTAG+EcTrpTGA的Bock+5htp和AZK+5htp。通过使用C端的多聚HisTAG从每个双重抑制系统中分离突变蛋白，然后进行SDS-PAGE和全蛋白ESI-MS分析，进一步证实了ncAA的成功掺入。

全长抗体的化学修饰已经成为开发新的生物疗法、诊断以及研究试剂的基石。在这方面，将多种不同的功能引入到抗体中的独有位置控制能力可能是一项变革性的技术。利用蛋白石抑制EcTrp对的新双重抑制系统可以更有效地促进抗体的更有效地表达-特异性地结合两个不同的ncAA。首先使用EcTrp+EcTyr系统表达了含有TAG和TGA密码子的全长曲妥珠单抗，分别位于重链(HC)的121位和轻链(LC)的169位。开发的EcTyrRS(pAAFRS)被用于结合含氮氨基酸pAAF以响应TAG，而5HTP是使用EcTrp系统在TGA中引入的。双突变体和野生型曲妥珠单抗分别在Expi293悬浮培养中瞬时表达。通过蛋白-G亲和层析从培养上清液中纯化了全长双突变体Trastuzumab-HC-121-paaf-LC-169-5htp，产率约为野生型的50%，比先前报道的双ncAA掺入抗体系统有显著改进。用DBCOTAMRA和重氮荧光素处理该曲妥珠单抗双重突变体，分别对HC和LC进行选择性标记，而对野生型曲妥珠单抗进行相同的处理，导致检测不到标记，进一步证实了预期多肽上存在这些独特的结合物。

鉴于EcTrp(TGA)对不与EcTyr和Pyl对发生交叉反应，并且EcTyr(Tag)和Pyl(TAA)对先前被证明是相互正交的，这三对似乎可以组合在一起，以促进三种不同的ncAA在哺乳动物细胞中特异性地结合到蛋白质中。

所有三个无意义密码子的重新分配确实提出了如何有效地终止翻译的问题。以前已经证明了多个连续的TAA密码子可以有效地终止在大肠杆菌中的翻译。为了克服由于不想要的ncAA掺入而在C末端潜在的异质性，作者等人还开发了一个自我切割的GTEVTAG。在这个系统中，报告蛋白后面跟着一个多组氨酸TAG、一个TEV裂解位点、TEV蛋白酶和三个TAA终止密码子。一旦表达，TEV蛋白的C端被裂解，留下带有纯化TAG和干净的C端的报告蛋白。为了证实GTEV表达系统在哺乳动物细胞中的功能，从该系统中表达了野生型EGFP，并使用C-末端多组氨酸TAG分离了它。SDS-PAGE和ESI-MS分析证实了完全加工的蛋白质的产生。

接下来，设计了一个同时整合三个ncAA的表达系统，由三个质粒组成，其中包括：1)GTEV表达的三重突变体EGFP报告基因(EGFP-3-Tag-40-TGA-152-TAA)，以及EcTyrRS/tRNACUAEcTyr对，2)EcTrpRS/tRNAUCAEcTrp对，以及3)MbPylRS/tRNAUAAPyl对。第三个质粒使用了最近开发的增强型tRNAPyl。这三个质粒共转染HEK293T细胞，在有或没有选择的ncAA的情况下用荧光法测定报告基因的表达。三种突变体蛋白的表达水平约为野生型EGFP WT的1%(表达自同一载体)。成功地分离了全长三重突变蛋白，并通过SDS-PAGE(图6B)和全蛋白ESI-MS进行了分析，结果显示大量与所需的三个ncAA的掺入一致。

本文作者：LRC

责任编辑：LRC

原文链接： https://doi.org/10.1002/anie.202219269

DOI：0.1002/anie.202219269