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CD8+T细胞的反应是保护人体免受癌症侵害的主要免疫机制之一，肿瘤中CD8+T细胞的存在表明癌症患者预后良好。目前颗粒酶B（GzmB）活性检测是监测癌细中CD8+T细胞细胞毒性活性的潜在有效策略。GzmB是一种丝氨酸蛋白酶，在T细胞中储存为不活跃状态，直到抗原驱动的识别促使其在癌细胞内释放和激活。而用于检测GzmB的探针（抗体和融合蛋白）不能区分酶的活性和非活性形式。因此作者设计了探针H5，可以很好的来检测GzmB。

首先，作者合成了8种探针包括四肽的T1和六肽的H1~7，经过实验验证所有六肽的表现都优于四肽T1，且探针H5在所有肽中表现出最快的响应和非常高的催化效率。另外作者还评估了探针H5对hGzmB的选择性优于其他酶。这些结果证实了探针H5对GzmB的反应性和选择性。

作者接着研究了其在癌细胞攻击期间测量T细胞细胞毒性活性的效果。作者共孵育小鼠CD8+T细胞和E0771乳腺肿瘤细胞，观察到探针H5对小鼠的GzmB具有良好反应，于是决定使用探针H5进行小鼠和人体测定。作者首先优化了培养物以提高GzmB的水平，再与IL-2孵育产生最大的再生，在IL-2处理后，许多CD8+T细胞表达GzmB并使用抗GzmB的荧光显微镜得到确认。接下来，作者将这些条件应用于CD8+T细胞和基因修饰的E0771-La2-NLR细胞的共培养，这些细胞表达红色荧光蛋白mKate47以促进其检测，并将其与探针H5和Annexin V-AF647（一种凋亡标记物）孵育。流式细胞仪分析显示，在活化T细胞培养的癌细胞中，H5和V-AF647的双重染色证实了H5免疫介导癌细胞死亡；在未活化的T细胞或用星孢霉素处理的癌细胞共培养显示出微弱的荧光，证实H5仅检测已被CD8+T细胞杀死的死亡癌细胞，而不是所有死亡癌细胞。此外，还观察H5仅染色mKate+癌细胞的细胞质，而没有染色T细胞。并且在T细胞无活性的共培养物或用可逆GzmB抑制剂Ac-IEPD-CHO预处理的共培养物中不会染色癌细胞。这些结果证实探针H5可以检测由活化的CD8+T细胞攻击引起的癌细胞死亡。

作者进一步研究H5在肿瘤消退小鼠模型中检测GzmB活性的能力。使用鳞状细胞癌小鼠模型去检测T细胞介导的肿瘤消退，用SCC/ FAK癌细胞或野生型SCC癌细胞（作为阴性对照）攻击FVB免疫能力小鼠，并将肿瘤生长2周。结果SCC/ FAK肿瘤明显更小，并且含有更少的活癌细胞。收获肿瘤并用探针H5处理30分钟，SCC /FAK癌细胞被H5 标记，而野生型SCC癌细胞没有，这些结果证实H5可以检测小鼠肿瘤中T细胞介导的细胞死亡。最后，作者去检测H5在免疫调节药物筛选和人类肿瘤临床测定中的效果，验证结果显示探针H5可以在体外用于高通量药物筛选分析以及人类肿瘤活检的临床表征。

总之，作者合成了一个FRET肽库，并鉴定出与颗粒酶B最佳拟合的探针H5。我们证明探针H5能够实时检测小鼠肿瘤和肺癌患者肿瘤中T细胞介导的抗癌活性。

本文作者：WHF

责任编辑：FJY

DOI:10.1038/s41467-022-29691-w

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29691-w