与大家分享一篇摘自Nature Chemical Biology的文章“Chemigenetic indicators based on synthetic chelators and green fluorescent protein”。本文开发了一种钙离子（Ca2+）指示剂，该指示剂将绿色荧光蛋白插入到HaloTag蛋白中，提供了敏感的离子指标，可用于细胞成像。
生物兼容的荧光指示剂的离子，如ca2+，Zn2+等，是种强大的工具，能够可视化细胞、组织和动物中离子的时空动态。使用最广泛的荧光指标可分为两类：基于小分子的合成指标和基于蛋白质的基因编码指标。为了结合合成分子和蛋白质的优势，本文作者报道了一类基于化学遗传组合的指标。首先作者将cpGFP插入到HaloTag的溶剂暴露位置，并创建了一系列32个蛋白变体。作者将这些杂交蛋白称为HaloGFPs。在鉴定出保留cpGFP和HaloTag功能的HaloGFP杂交种后，接下来作者用HaloTag反应性氯烷烃配体或含有BAPTA的卤代配体标记蛋白质。再将10种配体与32个HaloGFP杂交体进行体外反应，在Ca2+存在和不存在的情况下，获得320种组合的荧光发射光谱。作者发现在143-144残基上插入的HaloGFP杂交体，在所有测试组合中表现出最显著的荧光响应。其中具有配体4的HaloGFP杂交体的在这些激发扫描下的荧光变化最大。作者将在HaloTag的143-144处插入cpGFP的HaloGFP和配体4的组合命名为HaloGFP-Ca0.1–4。
为了进一步提高HaloGFP-Ca0.1-4的性能，作者通过使用定点半饱和诱变和全基因的随机诱变来创建文库，通过文库来实现定向进化，。经过六轮试验，作者筛选得到了最后一个变体，称为HaloGFP-Ca1-4。其发射强度ΔF/F0为920%（激发波为495nm），激发比ΔR/R0为2270%。这些反应的幅度高于许多以前报道的基于蛋白质的生物传感器。
为了探索HaloGFP-Ca1在细胞内[Ca2+]动态变化成像中的应用，作者制备了一种细胞可渗透的四乙酰氧基甲基（AM）酯衍生物4（称为11）。这种衍生物可以被动地渗入到细胞中，酯会被细胞内酯酶水解。在细胞中AM酯被裂解后，HaloGFP-Ca1-11（或HaloGFP-Ca0.5-11）与HaloGFP-Ca1-4（或HaloGFP-Ca0.5-4）相同。作者用编码HaloGFP-Ca1的基因（或HaloGFP-Ca0.5）转染HeLa细胞，用11（1μM处理细胞1h）。接着并用组胺处理细胞以诱导胞质[Ca2+]变化，并使用比值和强度检测模式进行荧光成像。结果显示HaloGFP-Ca1-11和HaloGFP-Ca0.5-11成功指示了4-氨基吡啶刺激下大鼠原代神经元Ca2+的增加。
本文作者：HSQ
责任编辑：HSQ
DOI：10.1038/s41589-022-01134-z.
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-022-01134-z
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