为大家分享一篇来自加州大学圣地亚哥分校药学系Jin Zhang教授在JACS杂志上发表的文章：Fluorescent Biosensor for Measuring Ras Activity in Living Cells。Jin zhang 教授课题组主要通过采用“天然生物化学”方法研究时空调节的分子机制和功能作用。她们试图能够在细胞时间和空间的框架内解开生命过程的化学机制，其中分子变化可以直接与功能效应相关联。结合遗传编码荧光生物传感器、超分辨率成像、靶向生化扰动和数学建模，目前正在研究cAMP/PKA的时空调控。

    小的GTPase Ras是细胞生长和增殖的关键调节因子。它的活性在癌症中经常失调，这促使人们进行了数十年的药理学靶向Ras的工作。理解Ras生物学和开发有效的Ras疗法都需要在其原生环境中探测Ras活性，但测量其在细胞中的活性的工具是有限的。在本文中，作者开发了一个Ras活性比值测定报告器(RasAR)，提供了活细胞中Ras活性的高时空分辨率定量测量。作者证明了RasAR可以探测Ras所有初级亚型的活细胞活性。鉴于Ras的不同亚型的功能作用与其亚细胞分布和调控密切相关，作者利用亚细胞靶向RasAR研究了Ras的时空调控，并揭示了Src激酶作为上游调控因子抑制HRas的作用。此外，作者还表明，在KRasG12C共价抑制剂(包括ARS1620、Sotorasib和Adagrasib)治疗后，RasAR能够捕获活细胞中的KRasG12C抑制动态。作者发现活细胞中残留的Ras活性在这些抑制剂存在的情况下持续数小时。总之，RasAR是一种在活细胞中研究Ras活性的强大分子工具，并促进Ras抑制剂的开发。

图1

    为了开发一种能够定量测量细胞Ras活性的生物传感器，作者利用来自Raf1的RBD作为传感组件，并试图通过使用oligand设计将结合变化转化为构象变化，作者利用与Raf1 RBD23结合的活性Ras的晶体结构作为蓝图，从Ras的效应结合区域推导出一个寡配体。GTP与Ras结合引发构象变化，使Ras的效应器结合区域与效应器RBD结合。来自该区域的多肽已被证明与RBD结合的亲和力较低。作者选择了配序列QNHFVDEYDPTI。Raf1 RBD和寡配体由连接子连接，夹在一对荧光蛋白mCerulean3和YPet之间(图1a,b)。细胞核输出信号(NES)也被附加到构建物的c端，以促进胞质定位(图1b)。在Ras缺失的情况下，oligand与RBD结合，使荧光蛋白靠近从而促进FRET。活性Ras与RBD结合会取代寡配，导致FRET降低(图1a)。为了测试适当的功能，作者在COS-7细胞中共同表达生物传感器，作者将其命名为Ras活性报告器(RasAR)，与KRasWT，组成活性(CA) KRasQ61L或KRasG12C，或显性阴性(DN) KRasS17N，每个ntermininal融合到mCherry。如图1c,d所示，表达KRasQ61L或G12C的细胞比表达KRasWT或S17N的细胞表现出明显更高的蓝黄(C/Y)发射比，表明表达Q61L或G12C的细胞具有更高的Ras活性。在生物传感器RBD中加入R89L突变(已知该突变会极大地破坏Ras结合)，大大减少了发射比差异(图1d)。

图2

    为了确定RasAR能否检测Ras动态活性，作者将该传感器与mCherry-KRasWT共表达于COS-7细胞中，并用表皮生长因子(EGF)刺激COS-7细胞。Ras通路激活后，作者观察到表达RasAR的细胞中C/Y发射比迅速增加[图2a]。与之前的研究一致，作者观察到在EGF刺激后膜褶皱中更高的C/Y发射比，表明这些区域KRas活性增强。此外，与Ras的高尔基定位一致，作者观察到高尔基腔室的活性增加(图2a)。加入EGFR抑制剂AG1478后，C/Y发射比降低(图2a)，显示了RasAR的可逆性。相比之下，与mCherry-KRasWT共表达RasAR (R89L)负调控传感器的细胞发射比没有变化。在表达mCherry- hraswt或mCherry- NRasWT的细胞中，EGF刺激也会导致RasAR C/Y发射比的增加(图2b)，而在EGF刺激后，RasAR (R89L)阴性对照未观察到C/Y发射比的增加。受egf刺激的发射比增加发生在膜折边和高尔基腔室(图2b、c)。这些结果表明，RasAR能够报告活细胞中的Ras活性动态。

Ras是一种重要的癌基因，是癌症治疗中广泛研究的分子靶点。然而，用于表征抑制剂效应的细胞分析需要使用Ras拉下分析，这是一种繁琐且难以扩展到高通量的方法。此外，这些测定需要细胞裂解，不允许对抑制剂的时空活性进行表征。利用能够测量Ras活性的比率生物传感器，作者试图用RasAR测量活细胞Ras抑制。该方法能够以高时空分辨率定量测定活细胞中的Ras抑制。Ras抑制的时间动态可以被跟踪，亚细胞抑制效应可以被比较，以提供有关活细胞中靶点参与的重要信息(图3a)。此外，完整的细胞环境包含完整的Ras/Raf/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路29和额外的交叉调节网络，这应该允许对整个通路的抑制作用进行测试。

图3

    为了测试RasAR在活细胞Ras抑制剂试验中的效用，作者首先关注了ARS1620，这是一种先前开发的KRasG12C抑制剂，它与gdp结合的KRasG12C结合并阻止核苷酸交换将KRasG12C和RasAR共表达细胞用10 μM ARS1620或DMSO孵育24 h。作者观察到，与ARS1620处理相比，DMSO处理的KRasG12C表达细胞的C/Y发射比更高，而KRasWT对照组的抑制剂处理则没有效果(图3b)。此外，作者在表达RasAR和mCherry-KRasG12C的COS-7细胞中测试了不同浓度(10,3,1,0.3和0.1 μM)的ARS1620。ARS1620剂量的降低对应着较高的C/Y发射比，证明了RasAR能够测量活细胞中KRasG12C的剂量依赖性抑制(图3c)。为了进一步证明活细胞测定法在表征Ras抑制剂方面的能力，作者下一步试图通过使用ERK活性报告(EKAR4)30来测量关键下游主调控因子ERK的活性，来测试ARS1620对Ras信号通路的影响。EKAR4作为ERK的替代底物，并报告ERK介导的磷酸化在CFP和YFP之间增加FRET。作者将mCherry-KRasG12C与EKAR4共表达，并用ARS1620处理细胞(图3d)。与预期的一样，作者观察到ARS1620处理对mCherry-KRasG12C表达细胞中EKAR4 Y/C发射比的影响大于mCherry- KRasWT表达COS-7细胞(图3d)，表明ARS1620可以有效抑制KRasG12C表达细胞中的Ras - ERK通路。

    总之，作者开发了一种新的生物传感器RasAR，其特点是基于oligand设计，用于报告活细胞中隔间特异性Ras活性的动态变化。与传统的生化分析方法相比，RasAR能够实时跟踪Ras活性动态。RasAR提供了一个比率读数，允许取消细胞变异和Ras活性的定量测量。

本文作者：ZLQ

责任编辑：ZLQ

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.2c05203