给大家介绍一篇来自“Angewandte Chemie International Edition”上的文章，题名为“Photocatalytic Chemical Crosslinking for Profiling RNA–Protein Interactionsin Living Cells “在这篇文章中，该课题组开发了一种光催化交联 (PhotoCAX) 策略，结合质谱 (PhotoCAX-MS) 和 RNA 测序 (PhotoCAX-seq) 来研究蛋白质-RNA 相互作用的组成和动力学。通过将蓝光触发的光催化剂与双功能 RNA-蛋白质交联剂 (RP-linker) 和基于相分离的富集策略相结合，PhotoCAX-MS 揭示了人类 HEK293 细胞中总共有 2044 个 RBP。

他们首先开发了一种有效的光催化交联化学来捕获 RNA 和 RBP 之间的直接相互作用。考虑到这些生物大分子反应性的多样性，他们设计了一种双功能交联剂（RP-linker），它由一个末端的胺基和另一个末端的呋喃基组成。在光催化条件下产生单线态氧 ( ¹ O ₂ ) 时，RBP 上的富电子侧链（例如，酪氨酸、色氨酸和组氨酸）被激活以与胺基共轭。呋喃基团可以转化为与胞嘧啶反应的 1,4-烯二酮中间体，以促进 RNA 标记，由于曙红的高效率以及与活体样品的相容性，选择曙红作为光催化剂，在蓝光照射下产生¹ O _{2 。}

图1

首先使用苄胺作为模型评估由曙红光催化引发的胺和蛋白质之间的共轭。生成的炔烃加合物通过铜 (I) 催化的炔烃 - 叠氮化物环加成 (CuAAC) 与生物素 - 叠氮化物衍生化，并通过免疫印迹法进行可视化。由数据得出结论，烷基胺是曙红介导的蛋白质标记的合适官能团。

图2

接下来评估了伊红介导的呋喃探针对胞嘧啶的标记效率和特异性。LC-MS 分析证实了光氧化偶联产物。他们进一步验证了呋喃的光氧化产物可用于标记从 HEK293 细胞中提取的 RNA 分子。但蛋白印迹分析表明，呋喃-炔烃探针仅标记 RNA，但不标记双链 DNA。与传统的 UV 介导的交联相比，PhotoCAX 表现出更高的交联产率。综上所述，上述特征证明了PhotoCAX 策略是一种在温和条件下在活细胞中偶联 RNA 和蛋白质的有效且高度特异性的措施。

将PhotoCAX 技术应用于活细胞中 RNA-蛋白质相互作用的全局分析。从 HEK293 细胞中提取交联的 RNA-蛋白质复合物，并用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析样品。在这个 PhotoCAX-MS 分析中，在三个独立实验中总共鉴定了 2044 种蛋白质，其中至少有两次重复实验中的 1402 种蛋白质。其中，827 种蛋白质以前没有通过 OOPS 或 XRNAX 方法在 HEK293 细胞中报道过。

图3

此外，通过利用这种化学方法，可以表征难以转染的 RAW 264.7 细胞的 RBPome 动态。NLRP3 作为一种新定义的 RNA 结合剂已在 LPS 刺激后在 RAW 264.7 细胞中得到验证，它与 lncRNA Malat1相互作用以促进炎症小体的启动和激活。最后，他们还分析了与 SARS-CoV-2 RNA 的 5' UTR 相关的宿主蛋白。这个方法揭示了多种 5' UTR 结合蛋白，包括参与病毒复制/转录的充分表征的宿主蛋白和其他几个具有 RNA 结合能力的蛋白家族，从而证明了 PhotoCAX 发现病原体 RNA 与宿主相互作用病毒感染期间的蛋白质组的能力。

总之，他们开发了支持光催化化学的 PhotoCAX 策略，用于对活细胞中 RNA 和 RBP 之间的直接相互作用进行全局和深入的分析和机制研究。RNA-蛋白质相互作用组分析方法可以对 RNA-蛋白质复合物的局部功能产生更深层次的见解。

作者：YXQ

责编：FJY

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202202008