Nat. Commun.|离子迁移-质谱法测定唾液酸O-乙酰化模式和糖苷连接类型

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为大家分享的是近期发表在Nature Communications上的一篇文章——Sialic acid O-acetylation patterns and glycosidic linkage type determination by ion mobility-mass spectrometry。本文通讯作者为乌得勒支大学的Javier Sastre Toraño和Geert-Jan Boons。本文作者描述了一种漂移管离子迁移-质谱方法，可以阐明从复杂生物样品中分离的唾液酸苷的确切的O-乙酰化模式以及糖苷连接类型，并对其应用进行举例说明。

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N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N -糖基神经氨酸(Neu5Gc)是哺乳动物表达唾液酸的主要形式。它们的4-、7-、8-和/或9-位可以被乙酰化，得到多达15种不同的O-乙酰化模式。进一步的结构多样性来自不同的Neu5Ac和Neu5Gc糖苷连接类型。

越来越多的文献将唾液酸O-乙酰化与多种疾病联系起来，包括癌症、免疫紊乱和感染。研究发现，O-乙酰化可以阻止糖结合蛋白的识别，如同一个分子开关；它还大大降低了几种人的内源性唾液酸酶的水解速率；另外，它还能够阻断细菌唾液酸酶的活性。最近对感染不同种类动物和人类的这些病毒的受体特异性的分析表明，受体识别的宿主特异性模式与乙酰化模式和糖苷连接类型有关。

所以，有必要研究唾液酸的乙酰化模式和糖苷连接类型。但是过去的方法，无法二者兼顾。在这里，作者描述了一种漂移管离子迁移-质谱[(IM)-MS]方法，可以同时阐明从复杂生物样品中分离的唾液酸苷的确切的O-乙酰化模式以及糖苷连接类型。在IM光谱(IMS)中，气相离子在电场的作用下通过充满气体的漂移池，根据流动性得以分离。不同的离子有着不同的电荷状态、大小以及形状，因而在漂移池的末端有着不同的到达时间分布（ATD）。到达时间可以转换为旋转平均离子中性碰撞截面(CCS)。这些固有的CCS值与离子表面积有关，结合m/z值，可以进行化合物的鉴定。

尽管IM-MS取得了一些进展，但实现IM-MS精确测定多糖结构的挑战是缺乏确定待测碎片离子CCS值的标准。在本研究中，作者采用大量合成的O-乙酰化、N-乙酰化和N-糖基神经氨酸来建立B1和B3碎片离子的CCS值库。此外，该研究的另一个重要方面是实现在不影响乙酰酯的情况下释放N-和O -聚糖——中性或微酸性条件下，PNGase或ENDO-F2处理可使N-聚糖释放，而次氯酸钠在pH为6.8时可氧化裂解O-聚糖。
接着，作者详细介绍了库的建立，下面仅对其中涉及结构鉴定的B1和B2离子进行介绍。


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图1 聚糖碎片离子的命名


B1离子能够有效区分不同类型的Neu5Ac和Neu5Gc的单乙酰化和双乙酰化异构体。对于Neu5Ac类型，4-O-乙酰化的Neu5Ac的B1离子具有最小的CCS值，其次是7-和9-O-乙酰化的Neu5Ac。Neu5Gc衍生物的B1离子呈现类似的趋势，尽管4-和7-O-乙酰化的Neu5Gc的B1离子的CCS值差异较小。B1离子还能够区分4,9-和7,9-双乙酰化的Neu5Ac和Neu5Gc。
B3离子也能提供结构信息。作者发现与相应的α2,6-连接化合物相比，α2,3-连接结构的B3离子漂移时间较长，因此CCS值较高，从而可以确定唾液酸的糖苷键类型。大多数有相同乙酰酯数量的B3离子可以分离，从而可以确定O-乙酰化位置。仅有从7-和9-O-乙酰化的α2,6-连接的Neu5Ac-LacNAc和Neu5Gc-LacNAc派生的B3离子不能被足够分辨，无法直接确定O-乙酰位置。

之后，作者举了IM-MS研究O-乙酰化的五个例子：

  1. 从生物制剂中提取的N-连接唾液酸苷的O-乙酰化

  2. 马气管和鼻组织中N-连接唾液酸苷的O-乙酰化

  3. 马α2-巨球蛋白N-连接唾液酸苷的O-乙酰化

  4. 甲型流感病毒受体特异性的聚糖微阵列分析

  5. 粘蛋白中的O-连接唾液酸聚糖的O-乙酰化


下面仅简要介绍第一个例子——从生物制剂中提取的N-连接唾液酸苷的O-乙酰化。

文章利用ATD和CCS值的数据库分析了两种在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中生产的生物药物的O-乙酰化唾液酸苷。CHO细胞系常用于表达治疗蛋白，据报道可以用 O-乙酰化唾液酸修饰 N-连接聚糖。

Myozyme（Genzyme）是一种α-葡萄糖苷酶，用于替代治疗Pompe病患者，具有至少6个已确认的N-糖基化位点。据报道Myozyme的N-聚糖上有单乙酰化和双乙酰化的唾液酸。

Aflibercept（Regeneron）是一种人VEGF受体细胞外结构域与人IgG1 Fc结构域的融合蛋白，用于治疗转移性结直肠癌。Aflibercept的VEGF受体结构域有四个N-糖基化位点；Fc结构域有一个，主要携带双角N-聚糖。在温和酸性条件下（100mM醋酸钠，pH 4.5），用ENDO-F2预处理糖蛋白，可以通过壳二糖核心的两个GlcNac残基之间的裂解，来释放大量的双角N-聚糖。
对Myozyme和Aflibercept分别鉴定了29种和21种双角N-聚糖。
Myozyme的MS数据显示，O-乙酰化的唾液酸苷约占总N-聚糖含量的3%，相当于约15%的唾液酸化N-聚糖。B1离子的CCS值确认了存在7-O和9-O的单乙酰化和7,9-双乙酰化的Neu5Ac。B3离子可检测到大多数单乙酰化的N-聚糖，确认它们是α2,3-连接的C-7或C-9乙酰化的唾液醛糖。三种双乙酰化N-聚糖的B1离子的CCS值与数据库中的7,9-双乙酰化模式相一致。对于最丰富的两种结构，B3离子的CCS值能够确定α2,3-连接类型。
在Afli bercept样品中，MS数据仅显示了一个O-乙酰化的N-聚糖——由于其低丰度，未能检测到B3离子，因此不能确定唾液酸连接类型。结果表明，IM-MS可以使用B1和B3碎片离子的CCS值阐明生物制剂中释放的N-聚糖的乙酰化位置和唾液酸连接类型。这是对以前只能通过MS确定O-乙酰化模式的重要补充。


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图2 源自生物制剂的O -乙酰化N -聚糖


总之，作者开发了一种新型方法——漂移管离子迁移-质谱方法，可以阐明从复杂生物样品中分离的唾液酸苷的确切的O-乙酰化模式以及糖苷连接类型，从而有助于我们对生物世界的探索。


本文作者：WAQ

原文引用：10.1038/s41467-023-42575-x

责任编辑：LD

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