Angew. Chem. Int. Ed.｜荧光颗粒酶A底物用于适应性免疫细胞活性的实时成像

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分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为“Fluorogenic Granzyme A Substrates Enable Real-Time Imaging of Adaptive Immune Cell Activity”文章的通讯作者为爱丁堡大学的Marc Vendrell教授。

细胞毒性免疫细胞包括T淋巴细胞(CTLs)和自然杀伤细胞(NK)，是宿主对抗肿瘤反应的重要组成部分。通过免疫疗法重新激活细胞毒性免疫细胞有望成为新的癌症治理手段，所以检测癌细胞中细胞毒性免疫细胞的活性可以了解免疫再激活的情况。目前大多数方法不能检测免疫细胞和癌细胞之间的功能性交叉信号，所以开发检测细胞毒性免疫细胞活性探针至关重要。细胞毒性免疫细胞在识别癌细胞时分泌颗粒酶A (GzmA)，因此检测颗粒酶A的活性在一定程度上可以反应细胞毒性免疫细胞的活性，颗粒酶可以在细胞毒性免疫细胞识别癌细胞之前作为无活性酶存储，所以很少有工具能够以高时空分辨率检测活性GzmA的生理水平。半氰胺显示出良好的生物相容性、近红外(NIR)激发和发射波长以及合理的荧光量子产率(图1)。半氰胺荧光团已被用于靶向不同的生物分子和酶，但还没有近红外荧光底物成像活性GzmA的例子。作者开发设计了一种基于颗粒酶A活性的荧光探针。探针由三部分组成，分别为半氰胺荧光团，间隔基团和颗粒酶A的底物。探针没有和粒酶A反应时，荧光团猝灭，当探针和活性颗粒酶A反应裂解，荧光团会恢复活性，并发出荧光信号。这种荧光探针可用于适应性免疫细胞活性的实时成像。
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图1.针对不同分子的半氰胺荧光探针以及对GzmA底物探针的设计。
作者构建Ac-Ile-Gly-Asn-Arg (Ac-IGNR)序列作为荧光GzmA底物。由于人GzmA (hGzmA)的二聚体结构以及二聚体界面与结合区接近，hGzmA活性位点会受到影响。为了克服这种潜在的空间位阻，作者在底物和荧光基团之间添加了一个间隔基团，一方面促进底物序列和酶之间的反应，另一方面猝灭荧光基团发射，只有在酶裂解后才检测到强荧光信号。为了优化间隔体的结构，作者比较了三种底物衍生物的生物相容性。首先作者合成了大量的Ac-IGNR-OH，接下来将四肽Ac-IGNR-OH(化合物1，图2)偶联到不同的芳香基上，生成等位酯、硫酯和酰胺衍生物(分别为化合物2、3和4，图2)。分析它们在不含hGzmA的水介质中的化学稳定性。如图2所示，化合物2和3在Tris缓冲液(pH 7.4)中完全水解，而化合物4在相同的实验条件下(纯度>95%)完全稳定，酰胺化合物4在碱性和酸性介质中是稳定的，而硫酯3在酸性pH下比羧酸酯2更稳定。最后，作者通过HPLC-MS证实了Ac-IGNR酰胺衍生物可以被重组hGzmA裂解，因此将该衍生物作为GzmA底物。
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图2.序列Ac-IGNR-OH(化合物1)的固相肽合成(SPPS)和相应的衍生物。该表显示了化合物2-4在不同pH值的缓冲液中HPLC-MS测定的稳定性。

在选择合适的间隔基团后，Asn残基和Arg残基的侧链分别被三苯基(Trt)和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰氯(Pbf)基团保护，如图3所示，作者合成了保护序列Ac-IGN(Trt)R(Pbf)-OH，从而使荧光团在肽的C端特异接合。我们将受保护的肽5以羧酸的形式分离出来，然后用2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)偶联得到化合物6。接下来，作者用PBr3处理将化合物6的羟基换成一个更好的离去基(化合物7)，并与半氰胺荧光团进行亲核取代，得到化合物8，经三氟乙酸(TFA)处理去除Trt和Pbf保护基团得到化合物9。

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图3.hGzmA荧光底物的合成方案。

接下来，作者测试了化合物9作为荧光探针检测活性hGzmA的能力。作者检测了化合物9与活性重组hGzmA的荧光发射，观察到酶促反应后有明亮的近红外发射，荧光增加了约20倍，在几个小时内稳定的荧光读数(图4a)。当丝氨酸蛋白酶抑制剂3,4-二氯异香豆素存在时，荧光信号降低了90%(图4b)。与肿瘤微环境中常见的其他蛋白酶相比，化合物9优先与活性hGzmA反应(图4c)。上述结果证实了化合物9与活性酶的反应性。最后，作者还比较了化合物9与商业底物Z-FR-AMC的性能，化合物9表现出更长的发射波长，而且荧光强度比Z-FR-AMC高18倍(图4d)。

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图4.化合物9对hGzmA反应的体外表征 a)在Tris缓冲液(pH=8)中hGzmA 不存在和存在时，化合物9在37°C下的延时荧光发射(725 nm)。插图是化合物9与hGzmA反应后的动力学常数。b)化合物9与hGzmA孵育后以及加入3,4-二氯异香豆素后，在Tris缓冲液(pH=8)中的荧光光谱。c)化合物9与不同蛋白酶在37℃孵育60分钟后荧光强度。d)化合物9和Z-FR-AM与hGzmA在Tris缓冲液(pH=8)中孵育60分钟后的荧光强度。数据为±标准差(n=3)。
NK细胞能够将颗粒酶分泌到细胞外空间，并在癌细胞中引起细胞毒性。为了测试化合物9在细胞上清液中测量活性GzmA的有效性，作者在人NK-92细胞中进行了脱粒试验，NK-92细胞被佛波肉荳蔻醋酸(PMA)和离子霉素刺激。收集细胞上清液，与化合物9孵育1小时，然后进行光谱测定。如图5a所示，受刺激的NK-92细胞上清液中荧光比未受刺激的细胞更亮，这种荧光被蛋白酶抑制剂3,4-二氯异香豆素阻断，颗粒酶活性可在NK-92细胞内检测到，而且颗粒酶可在活化的免疫细胞内发现。在化合物9孵育后对NK-92细胞进行了活细胞共聚焦显微镜观察，如图5b所示，化合物9在NK-92细胞中显示出明亮的胞内荧光，在3,4-二氯异香豆素存在时信号减弱。这些结果表明，化合物9也可以用于人NK-92细胞的荧光成像。

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图5.人NK-92细胞中GzmA活性的检测。a)NK-92细胞的激活诱导活性GzmA分泌到细胞外空间，随后用化合物9标记。b)NK-92与化合物9(红色，5µM)孵育1小时后的荧光共聚焦显微镜图像。c)受刺激细胞和非受刺激细胞上清液的相对荧光发射(725 nm)。数据以均值±标准差表示(n=3)。

为了进一步评估探针检测活性GzmA的能力，作者在表达GzmA的野生型C57BL/6小鼠和敲除GzmA(-/-)小鼠中进行了测试。先前的研究报道小鼠GzmA (mGzmA)和hGzmA没有相同的底物偏好，因此作者合成了新的化合物10(图6a)。用化合物9和10孵育败血症小鼠的血清，观察到后者荧光增加了7倍以上(图6b)。接下来，通过淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)刺激野生型(WT)和GzmA敲除小鼠体内颗粒酶的表达，从小鼠中提取脾脏和肝脏，并在相同的实验条件下用化合物10孵育它们的裂解物，野生型的裂解液荧光信号比GzmA敲除组的裂解液荧光信号更亮，说明化合物10能够更好地与活性mGzmA反应(图6b)。因此，作者决定使用化合物10作为荧光探针，实时测量抗原特异性激活CTL靶向的癌细胞中的GzmA活性。利用含有靶向SIINFEKL抗原的OT-I转基因受体的CD8+ T细胞，并将其与SIINFEKL处理的小鼠EL4癌细胞共培养，其中凋亡早期和晚期细胞凋亡中发现了更高水平的活性GzmA(图6c)。最后，作者还利用这种共培养系统实时可视化GzmA和GzmB的纵向活性，作者课题组最近报道了探针H5可作为活性GzmB的绿色荧光探针，与化合物10无重叠发射。CD8+ T细胞首先用CellTrackerTM Orange作为反染剂进行标记，然后在化合物10和探针H5的存在下与癌细胞共培养，通过延时荧光显微镜监测两种颗粒酶的激活和定位。实时图像显示EL4癌细胞中这两种酶的活性几乎同时显现(图6d)，这表明CTL在抗原驱动识别时可以同时释放活性的GzmA和GzmB。这项研究实现了癌细胞和适应性免疫细胞共培养中颗粒酶活性的实时多路成像。

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图6.化合物10在离体小鼠组织和CD8+ T细胞-癌细胞共培养中成像活性mGzmA。a)化合物10的化学结构。b)左图为化合物9和10孵育的败血症小鼠血清的荧光发射信号，右图为用化合物10孵育的野生型(WT)小鼠和GzmA敲除小鼠的脾脏裂解物的荧光发射信号。c) EL4癌细胞与CD8+ T细胞共培养和化合物10(2.5µM)孵育前后的流式细胞分析的直方图。平均荧光强度表示为均值±SD (n=3)。d) CD8+ T细胞和EL4癌细胞共培养的延时荧光显微成像

综上所述，作者设计开发了一种近红外荧光颗粒酶A底物探针，用于适应性免疫细胞的实时成像。这些活性探针表现出出非常高的催化效率和选择性，可以实时成像适应性免疫细胞对抗原驱动的癌细胞识别的反应。

原文链接： https://doi.org/10.1002/anie.202216142

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