分享一篇2022年发表在Angew上的文章，题目是“Engineering of Reversible NIR-II Redox-Responsive Fluorescent Probes for Imaging of Inflammation In Vivo”。文章的通讯作者为湖南大学袁林教授。近红外二区荧光(NIR-II，1000-1700 nm)与可见光(VIS，350-700 nm)或近红外一区荧光(NIR-I，700-900 nm)相比，可以有效地避免光子散射和自体荧光背景，从而穿透深层生物组织进行高分辨率成像，这对于深层组织疾病的生物学研究和评估具有重要意义。因此基于近红外二区的可激活型荧光探针引起了越来越多的关注。动态氧化还原稳态对于生物系统的正常功能至关重要，生物氧化还原状态的改变与生理和病理过程密切相关。生物系统的氧化还原反应状态主要是由于活性氧类(ROS)水平与还原当量如谷胱甘肽(GSH)，H2S，硫氧还蛋白和抗坏血酸之间的动态平衡。因此，开发一种NIR-II可逆荧光探针来研究体内水平组织中的氧化还原循环具有重要的生理和病理意义。迄今为止，几乎所有可用于检测 ROS或还原当量的NIR-II荧光探针都是基于染料结构的氧化破坏，氧化/还原脱保护以释放发射的NIR-II染料，或与亲核的还原性物质H2S的亲核取代反应。然而，先前报道的这些探针的传感机制都是不可逆的，即只反映了一个方向的氧化或还原变化，但不适合跟踪氧化还原循环。因此，开发可靠的策略来显示可逆的氧化还原反应的NIR-II荧光探针是至关重要的。基于此问题，在这项工作中，作者以三甲基菁为骨架，构建了一系列NIR-II Cy3染料(NIR-II Cy3s)（图1），其在不同溶液中的吸收/发射超过930/1000 nm（图2）。与已报道的七甲氨基染料IR 26/IR 1048/IR 1061/Flav 7/CX-3相比，NIR-II Cy3s 对活性氧/硫(ROS /RSS) 的化学稳定性显著改善。此外，将富电子端基1,4-二乙基-十氢喹喔啉(DQ)引入到NIR-II Cy3s中对于增加其波长至关重要，并且提供了氧化还原反应位点来构建一系列可逆的NIR-II探针以检测 HClO/RSS 介导的氧化还原环境。此外，比率吸收的变化表明，NIR-II探针具有比率光声成像的潜力。NIR-II Cy3-988被成功地用于氧化还原稳态变化的可逆检测，检查药物治疗在炎症过程中的作用，监测肝损伤和通过氧化还原电位变化进行修复。
图1 NIR-II型Cy3的分子设计与光谱性质。a)传统的七甲基花青NIR-II染料; b) Cy3-7(5 μM)在白光照射或磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的HClO (50 μM)(10 mM，pH 7.4，含有50% EtOH)的光化学稳定性; c)基于三甲基花青骨架设计NIR-II发射有机染料的策略。
图2 a)在 B3LYP/6-31G (d)水平上，基于TDDFT计算研究Cy3，NIR-I Cy3-728/784和 NIR-II Cy3-938/956/988的光物理性质与HOMO/LUMO能级之间可能关系的理论计算; b) ，c) Cy3，NIR-I Cy3-728/784和 NIR-II Cy3-938/956/962/988的归一化吸收和发射光谱。
通过体外荧光测试发现与已报道的七甲氨基染料 IR 26/IR 1048/IR 1061/Flav 7/CX-3相比，NIR-II Cy3s对活性氧/硫(ROS/RSS)的化学稳定性显著改善（图3，a-f）。该系列染料仅在HClO存在下荧光发生猝灭，吸收蓝移的现象（图3，j, i），而随后用还原性巯基化合物再次处理后，荧光信号恢复，表现出了可逆响应HClO与RSS的性质，高分辨质谱证实了该可逆过程的反应机理（图4）。
图3 a)-f)存在或不存在ONOO-(5 μM)或H2S (100 μM)时，5 μM NIR-II Cy3(a NIR-II Cy3-988，b NIR-II Cy3-962，c NIR-II Cy3-956，d NIR-II Cy3-938) ，CX-3(e)和IR 1048(f)的吸收光谱;G)在PBS (10 mM，pH 7.4，含有50%乙醇)中，NIR-II Cy3-988(5 μM)对不同物质(H2O2 200 μM，HClO 50 μM，ONOO- 5 μM，H2S 100 μM，Cys 100 μM，GSH 1 mM，HSO3- 10 μM)的归一化荧光强度(1040 nm);H) ，i)在 PBS (10 mM，pH 7.4，含有50% EtOH)中与 HClO (15 μM)反应之前(黑线)和之后(红线)的 IR 1048(5 μM)和 NIR-II Cy3-988(5 μM)的吸收光谱。
图4 a) NIR-II Cy3-988可逆检测HClO和H2S的可能机制; b)在PBS (10 mM，pH7.4，含50% 乙醇)中，研究NIR-II Cy3-988(5 μM)对高分辨率质谱法处理HClO和H2S的可逆机制;C) ，d)用(c) HClO (0-15 μM)滴定后NIR-II Cy3-988(5 μM)的荧光强度变化，然后加入(d) H2S (0-3.5 μM) ;E)加入HClO (15 μM)后NIR-II Cy3-988(5 μM)的氧化还原循环，然后在 PBS (10 mM，pH7.4，含有50% EtOH)中 H2S (3.5 μM)处理; f)用 HClO (0-20 μM)滴定后 IR 1048(5 μM)的荧光强度变化，然后加入 H2S (20 μM) ;G) ICG 和 NIR-II Cy3-988/962/956/938在含有50% 乙醇的1 mM 谷胱甘肽的 PBS (10 mM，pH7.4，含有50% 乙醇)中的光稳定性，在100 mW cm-2激光持续辐射下30分钟(ICG 为808nm，NIR-II Cy3-962/956/938为915 nm，NIR-II Cy3-988为980 nm);H)在 PBS (10 mM，pH7.4，含有50% 乙醇)中各种 NIR-II 染料(5 μM)的荧光强度; a) NIR-II Cy3-988，b) NIR-II Cy3-956，c) NIR-II Cy3-962，d) IR 1061，e) Flav 7，f) IR 1048,1100LP。接下来，作者研究了探针 NIR-II Cy3-988基于其对氧化应激(HClO 和RSS)的可逆检测，用于体内评估药物疗效。在角叉菜胶诱导的炎症模型下，近红外有效区分了三种市售抗炎药的抗炎作用。结果显示，双氯芬酸处理后的小鼠可以恢复由角叉菜胶在小鼠中诱导的降低的NIR-II荧光信号，表现出了最佳的抗炎作用（图5）。
图5 a) NIR-II Cy3-988用于角叉菜胶诱导的急性炎症和药物介导修复的 NIR-II 荧光成像示意图。将小鼠的后腿用 PBS (20 μL，左后腿)或角叉菜胶(20 μL，5 mg mL-1，右后腿)预处理72小时，然后用抗炎药(双氯芬酸，阿司匹林，布洛芬; 10mg Kg-1，尾静脉注射，i.v.)处理30分钟，然后直接用于用 NIR-II Cy3-988成像(50 μL，200 μM，肌内注射，IM); b)在用 PBS，双氯芬酸，阿司匹林或布洛芬治疗后的代表性时间点，角叉菜胶诱导的急性炎症模型中后腿的 NIR-II 荧光成像;C)-f)在用PBS (c)，双氯芬酸(d) ，阿司匹林(e)和布洛芬(f)处理后的代表时间点，卡拉胶诱导的急性炎症模型中 NIR-II Cy3-988的 NIR-II 荧光强度;G)炎症模型中 HClO 产生和免疫荧光染色的示意图; h)在 PBS 处理的小鼠中巨噬细胞(FITC-f4/80抗体，绿色荧光)和(髓过氧化物酶) MPO (Cy3-MPO- 抗体，红色荧光)的代表性免疫荧光染色，卡拉胶诱导的急性炎症模型和双氯芬酸处理的模型。
最后，作者研究了探针NIR-II Cy3-988通过NIR-II荧光成像可逆地监测肝损伤和体内修复的过程(图6a)，并将结果与临床批准的造影剂ICG进行比较。两种染料的重叠图像证明NIR-II Cy3-988和ICG分布在肝组织中几乎相同的位置。这些结果表明，NIR-II Cy3-988不仅与ICG一样，可用于肝毒性的可视化研究，还能够反映出检测肝毒性过程中氧化还原的动态平衡。
图6 四氯化碳(CCl4)和 NAC介导的肝损伤/修复过程; b)用各种物质处理的 ICG (808 nm 激发，绿色)和NIR-II Cy3-988(980 nm 激发，红色)的小鼠肝脏的NIR-II荧光成像: 盐水(对照) b1-b3，CCl440% (损伤) b4-b6和NAC + CCl4 40% (修复) b7-b9;用生理盐水，CCl4 40% 或 NAC + CCl4 40%预处理小鼠12小时，然后在尾静脉注射 ICG 之前给予NIR-II Cy3-988(100 μL，100 μM，i.v.)3小时(100 μL，100 μM),(生理盐水/ CCl4 40% : 100 μL，皮下注射，NAC: 600mg/kg-1，腹腔注射(i.p.)) ，1100LP，NIR-II 荧光在808 nm 激光激发的 ICG 给药30分钟后发生; c)对照组(b1，b2) ，损伤组(b4，b5)和修复组(b7，b8)中 ICG 和 NIR-II Cy3-988的相应荧光强度;D)曲线剖面图: b3中图像重叠处白线的强度剖面图; e)曲线剖面图: b6中图像重叠处白线的强度剖面图;F)用生理盐水预处理小鼠12小时，然后给予NIR-II Cy3-988(100 μL，100 μM，iv)和 ICG (100 μL，100 μM，iv)用于NIR-II荧光成像808 nm (对于ICG)和980 nm (对于 NIR-II Cy3-988)激光激发，1100LP;G)用CCl4预处理小鼠12小时，然后施用 NIR-II Cy3-988(100 μL，100 μM，iv)和ICG (100 μL，100 μM，iv)用于NIR-II荧光成像808 nm (对于 ICG)和980 nm (对于NIR-II Cy3-988)激光激发，1100LP;H)用 CCl4预处理小鼠12小时，然后给予NIR-II Cy3-988(100 μL，100 μM，i.v.)和 ICG (100 μL，100 μM，i.v.) ，然后获得 NIR-II 荧光图像。随后，在60分钟用 NAC (i.p.)处理小鼠，用808 nm (对于 ICG)和980 nm (对于 NIR-II Cy3-988)激光激发，1100LP; i) ，j)在正常，损伤和 NAC 处理的肝脏中 NIR-II Cy3-988i)和ICG j)的荧光强度的相应变化。
这项工作通过在三甲基菁骨架中引入DQ苯并吡喃并逐步优化，开发出一系列具有较高抗猝灭性能的新型高稳定性NIR-II染料NIR-II Cy3。与传统的七甲基菁NIR-II染料相比，NIR-II Cy3在HClO/RSS介导的氧化还原环境中具有骨架的稳定性和富电子DQ基团对HClO/RSS的可逆反应，可用于HClO/RSS介导的可逆检测。NIR-II Cy3-988已成功地用于检测急性炎症和肝损伤/修复模型中氧化微环境的变化，也可用于急性炎症过程中的药效评价。同时作者也对此工作做了展望，如提高探针的量子产额和水溶性，实现可逆的NIR-II比率测定。
文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202211409.
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