分享的是一篇2022年发表在JACS上的文章Live-cell RNA imaging with metabolically incorporated fluorescent nucleosides，文章的通讯作者是普林斯顿大学化学系Ralph E. Kleiner教授和圣地亚哥州立大学化学与生物化学系Byron W. Purse教授。

RNA 在生物学中发挥着核心作用，探索其动态行为对于阐明基本生物过程的机制至关重要。目前在活细胞中可视化 RNA 动力学的方法主要集中在对单个转录本进行成像。

研究细胞 RNA 动力学的一种补充方法是将修饰的核苷掺入细胞 RNA。使用生物正交化学用荧光染料标记，并用于可视化完整细胞和生物体。然而，这些代谢结合的生物正交核糖核苷成像主要在固定细胞或组织切片中进行。这主要是由于依赖于 Cu(I) 催化的叠氮化物-炔烃环加成 (CuAAC)(12)用于荧光标记，这与活细胞不相容，并且需要“洗掉”用于驱动标记反应完成的多余未反应染料。虽然这些方法功能强大，但生物正交标记可能会由于固定或由于荧光染料与细胞结构的非特异性结合而引入偏差。

用于用生物正交核糖核苷对 RNA 进行成像的两步程序替代方法是荧光核苷的直接代谢掺入（图 1a）。由于这种策略在 RNA 掺入后不需要荧光团标记反应，并且含有多个修饰核苷的 RNA 转录物荧光应该超过单个修饰核苷或核苷酸的荧光背景，它应该能够实现全球转录组动力学活细胞 RNA 成像。已经报道了大量的荧光核苷类似物。然而，这些结构主要用于体外应用，通过化学合成或体外转录掺入RNA，尚不清楚它们是否适合代谢掺入RNA的底物。

尿苷-胞苷激酶 2 (UCK2) 的磷酸化是 C5 修饰的嘧啶核苷代谢掺入的瓶颈，并且激酶突变形式的表达能够用 5-叠氮甲基尿苷 (5-AmU) 进行代谢标记。作者证明了 UCK2 在细胞中的表达有助于用吡咯胞苷 (pyrroloC) 标记 RNA和 1,3-二氮杂-2-氧代吩噻嗪 (tC)荧光核糖核苷。并且揭示了氧化应激对 RNA 代谢的影响，并确定了一种新的应激依赖性 RNA 蛋白颗粒的形成。

为了测试核苷掺入，作者用每种荧光核苷处理细胞 12 小时，然后在去除游离核苷后通过荧光显微镜进行成像。在用 tC 或 pyrroloC 处理并诱导表达 WT 或 Y65G UCK2 的细胞，观察到强荧光标记（图2a ，b）。荧光信号集中在细胞核中，也存在于细胞质中，与 RNA 掺入一致。有趣的是，对于 pyrroloC 和 tC，作者观察到与 Y65G 突变体相比WT UCK2 细胞中的荧光更高，这与之前使用含有无环取代的 C5 修饰的尿苷类似物的结果形成对比。在没有 UCK2 过表达的细胞中，检测到最小的荧光（少 52 倍）（图 2a，b），表明内源性 UCK2 水平不足以进行稳定的磷酸化和掺入。对于MeO tC 和DEA tC 衍生物，无法在任何测试条件下观察到荧光细胞标记。此外，DEA tC 在延长治疗时间后表现出显着的细胞毒性。

图 2. 使用成像和 LC-QQQ-MS 检测荧光核苷掺入细胞 RNA。(A) 将荧光核苷掺入 HeLa Flp-In WT UCK2 细胞。用四环素诱导 UCK2 表达， 500 μM 核苷处理细胞 12 小时并成像。四环素诱导以作为 UCK2 表达的对照。(B) 将荧光核苷掺入 HeLa Flp-In Y65G UCK2 细胞中。如 (A) 所示处理和成像细胞。(C) 使用 LC-QQQ-MS 定量细胞 RNA 中荧光核苷的工作流程。(D) tC 或 pyrroloC 的 RNA 掺入到用 UCK2 构建体转染的 HeLa 细胞中。(E) tC 或 pyrroloC 在稳定表达诱导型 UCK2 WT 或 Y65G 突变体的 HeLa 细胞系中的 RNA 掺入。

结果表明， WT 或 Y65G UCK2 激酶在任一表达系统中的过表达导致 pyrroloC 的 RNA 掺入增加约 20 至 100 倍（图 2 d, e, )。使细胞实现了最高水平的 pyrroloC 标记（C 的 1.1 ± 0.02%), 稳定表达诱导型 WT UCK2（图2e）。在 WT UCK2 或 Y65G UCK2 表达后，用 tC 标记的 RNA 增加了约 4 到 8 倍，尽管总体掺入水平略低于用 pyrroloC 核苷达到的水平（图 2 d，e）。DEAtC 和MeO的掺入量tC 使 LC-QQQ-MS 分析无法在消化的总 RNA中检测到DEA tC 核苷，这与细胞成像实验一致（图 2a、b）。

在 UCK2 表达时使用 tC 和 pyrroloC 进行有效的细胞 RNA 标记，寻求该系统以对活细胞中的实时 RNA 动力学进行成像。为实现这一目标，用 pyrroloC 或 tC 处理表达 UCK2 的 HeLa 细胞，并使用共聚焦荧光显微镜检测标记的 RNA。在存在 RNA 合成抑制剂 ActD 的情况下，用不同的血清浓度进行 RNA 标记。用 200 μM tC 处理细胞并在 6 小时后监测荧光，在细胞质和细胞核中观察到 tC 荧光，核仁是 rRNA 合成的主要部位，信号增强，与掺入 RNA 转录一致。ActD 联合处理后荧光显着降低（图4a ), 表明大部分信号源自含 tC 的 RNA 转录物，而不是荧光 tC 代谢物（核苷酸）。此外，与血清浓度降低相比，在 10% 胎牛血清存在下用 tC 处理时，发现荧光信号增加了 59%（图 4 a，b），这与 RNA 转录上调的报道一致随着增长率的提高。(22)接下来，研究了用 tC 标记 RNA 的动力学。我们在 30 分钟的时间点观察到细胞荧光（图 4 c，d），表明 tC RNA 标记可用于报告动态细胞过程。荧光信号随时间增加并在 6 小时达到平台期（图4c）。

图 4. 使用 tC RNA 标记的细胞 RNA 动力学的活细胞成像。(A), tC 掺入 5% 或 10% FBS 或存在 ActD 的细胞中的代表性图像。(B),  (A) 中处理的细胞的荧光强度量化。(C), tC 掺入细胞 RNA 的时间过程分析。(D),(C) 中处理的细胞的荧光强度量化。(E), 在与 200 μM NaAsO 2共处理期间，tC 掺入细胞 RNA 的时间过程分析. (F), (E) 中处理的细胞的荧光强度量化。(G) 用 tC 脉冲 4 小时并用完全培养基或 200 μM NaAsO 2在培养基中追逐的细胞的代表性图像。(H) (G) 中处理的细胞的荧光定量。(I), 在压力条件下与 G3BP1、DCP1A 或 DDX6 形成的 RNA 病灶的共定位。(J), 应激和 RNA 合成抑制剂处理下细胞 RNA 数的量化。

氧化应激引起细胞生理学的许多变化，伴随着翻译和转录程序的改变，但氧化对 RNA 动力学的影响仍然有待探索。为了研究应激条件下 RNA 动力学，在亚砷酸钠诱导的氧化应激期间用 tC 核苷进行代谢标记，并在开始喂养和应激后的多个时间点对细胞进行成像, 观察到亚砷酸盐胁迫期间的双相响应tC 荧光在处理的第一个小时内增加，随后从连续暴露亚砷酸盐的 1 小时到 4 小时稳步下降（图 4 e，f）。相反， 4 小时内无压力细胞中 RNA 中的 tC 积累不断增加（图 4 c，d）。NaAsO 2与未受压细胞中不规则形状的核仁相比，经处理的细胞显示出核仁 RNA 信号的变化，显示出更多数量的核仁，其尺寸减小且球形更规则（图4e ）。由于 NaAsO 2暴露会影响 RNA 合成和降解，接下来进行了脉冲追踪标记实验，以专门研究 RNA 周转率。在存在或不存在 NaAsO 2的情况下，将细胞在 tC 中喂食 4 小时，然后在无 tC 培养基中进行 30 分钟追踪。在含有NaAsO 2的培养基中，tC 标记的 RNA的荧光信号在追踪期间强烈降低 (55%) ，而在 30 分钟的追踪期间，无应力细胞中 tC 标记的 RNA 水平仅降低了 18%（图 4g,h)。总之，研究表明大量 RNA 降解响应于 NaAsO 2胁迫而迅速增加，但它们不支持亚砷酸盐胁迫对 RNA 合成的急性影响。此外，发现核仁 RNA 定位发生了改变，这表明氧化应激影响 rRNA 合成和/或加工。

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.2c04142