为大家分享一篇发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章“Discovery of a Potent Deubiquitinase (DUB) Small-Molecule Activity-Based Probe Enables Broad Spectrum DUB Activity Profiling in Living Cells”。

去泛素酶（DUB）可水解连接泛素与蛋白质底物的异肽键，会减少泛素蛋白酶体系统对底物的降解，DUB活性的失调与许多疾病有关。泛素衍生的共价活性的探针（ABPs）为DUB活性分析提供了强大的工具，但它们的大识别元件阻碍了细胞渗透性，且小分子ABP 的需求未得到满足，而小分子ABP可以解释完整细胞或生物体中DUB活性的调节。迫切需要改进化学工具和技术，以更好地了解 DUB 在健康和疾病中的丰度、定位、活性和底物概况。在这里，作者发现了小分子氰基吡咯烷（CNPy）探针IMP-2373，用于监测活细胞中的DUB活性。

作者首先设计合成了14个吡咯苯酰胺探针库，选择种骨肉瘤、胶质母细胞瘤和乳腺癌 细胞系进行初始探针筛选实验，通过蛋白质谱分析数据确定了CNPy 12。接下来，又比较了42组重组DUB的细胞活性和选择性与抑制酶活性的能力的指示性评估。CNPy 12表现出优于其他探针的特征，与蛋白质组学分析观察到的相似。因此将该探针用于下一步的实验，并重命名为IMP-2373。    

接下去，作者探索了探针浓度和延长孵育时间来优化DUB的结合。通过蛋白谱分析数据得出，在一个或多个浓度下，共有28个DUBs比DMSO对照组富集。并且，由标准HA标记的泛素丙基酰胺ABP参与的20个DUBs的富集可以被IMP-2373 所取代。相对蛋白质丰度的统计分析表明，DUB相对于所有已识别的蛋白质和一般水解酶都有差异富集。为了确认DUB催化活性对细胞靶标参与的依赖性，在HEK293T细胞中表达了一系列不同的flag标记的野生型DUB（UCHL1, USP30, USP7和OTUB1）。IMP-2373处理后，对亲和富集的DUB进行Western blot分析，结果表明IMP-2373可以选择性地作用于被测DUB的催化半胱氨酸。

作者紧接着探索了IMP-2373作为选择性DUB抑制剂参与细胞内靶标的竞争性探针的能力。用UCHL1（IMP-1711-S）或USP30（FT385 )选择性活性位点抑制剂预处理细胞1小时，然后用IMP-2373预处理1小时。通过下拉和western blot分析，证实了每种抑制剂对细胞内靶标的有效和选择性浓度依赖性。最后探索了IMP-2373监测疾病模型中DUB活性变化的潜力，使用 B细胞淋巴瘤MYC 失调模型，用IMP-2373处理后进行蛋白质组分析。结果证实了IMP-2373在B细胞淋巴瘤模型中MYC失调期间实现差异DUB活性分析。    

总之，作者构建了活性探针IMP-2373，是最有效和最具选择性的泛DUB小分子ABP，并在完整细胞中分析 DUB活性和DUB抑制剂，为揭示DUB活性调节的研究提供有用补充。

本文作者：WHF

责任编辑：FJY

DOI：10.1002/anie.202311190

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202311190