分享一篇发表在 nature communications 上的文章，题目为“C-terminal modification and functionalization of proteins via a self-cleavage tag triggered by a small molecule”。蛋白质C末端的精确修饰至关重要，但目前仍充满挑战。本文通过融合目标蛋白C末端的半胱氨酸蛋白酶结构域，开发了一种修饰C端的化学方法，该方法将半胱氨酸蛋白酶结构域融合在目标蛋白的羧基端，通过Insp6触发的半胱氨酸蛋白酶结构域自裂解实现羧基端非酶功能化。该方法是一种高效实现蛋白质C末端功能化的方法，并且适用于多种含胺分子和蛋白质。此外，通过将C端修饰蛋白与半胱氨酸蛋白酶结构域和Insp6孵育，发现了一种可逆的C端去功能化，为蛋白质的功能化和去功能化提供了工具。最后，本文提供了蛋白质C端功能化的各种应用，纳米抗体药物偶联物、纳米抗体糖/肽偶联物、双特异性抗体的制备以及抗体C端的荧光标记，展示了该方法的广泛的应用场景。

蛋白质的化学修饰可改善蛋白的理化性质，赋予蛋白新的生理学功能，比如延长半衰期、标记靶标受体、调节蛋白-蛋白相互作用等，目前已经有大量研究对蛋白质进行了大量的位点特异性修饰，包括N端或C端修饰，氨基酸的侧链修饰。相较于蛋白质氨基酸侧链及N端修饰技术的快速发展，蛋白质C端修饰策略仍比较匮乏。其中，经典的C端修饰方法主要为化学酶法，需要在目标蛋白质的C端融合特定标签，利用酶催化反应将合成的含有相应氨基酸序列的修饰片段共价偶联到蛋白质C端。但是，基于化学手段的蛋白质C端修饰方法还很缺乏。因此，开发新型的、纯化学的、底物范围广泛的C端修饰策略具有重要意义。

半胱氨酸蛋白酶结构域(cysteine protease domain, CPD)是一种广泛用于提高POIs的表达、溶解或纯化的C端标签。与应用于蛋白质表达的其他标签相比，CPD标签的去除更为方便，只需要一个商业化小分子Insp6的催化等效物。目前的研究发现，阻断CPD中游离半胱氨酸将抑制其自裂解的过程，这表明游离的半胱氨酸是触发CPD自裂解的关键残基。通常，半胱氨酸的巯基攻击肽键并形成硫酯中间体，硫酯中间体可被水进一步水解形成游离羧基。据此，研究人员推测在Insp6诱导CPD裂解过程中形成了硫酯中间体。硫酯是天然化学连接中的重要中间体，能与肼、胺、半胱氨酸等进一步反应。研究人员发现在Insp6触发的CPD自裂解过程中，POI的C端可以被含胺的分子同步修饰。因此，研究人员此推测额外加入的氨基化合物可与硫酯中间体反应形成新的酰胺键，在标签脱除的同时实现对蛋白质C端的衍生化。

为了验证该假设，研究人员将CPD融合蛋白Endo-F3(D165A)- CPD(100 μM)与3-叠氮丙胺 (50 mM)在4℃的PBS中孵育30分钟，其中加入或不加入(w/o) Insp6 (100 μM)（图1）。通过LC-MS来检测Endo-F3(D165A)的分子量。根据LC-MS结果，Endo-F3(D165A)-CPD(分子量55616)与Insp6孵育得到两个主要的LC-MS结果(图1a)， 23745(与CPD一致)和31888(与Endo-F3(D165A)一致)，说明在Insp6作用下融合蛋白发生裂解，释放CPD。同时，仅将融合蛋白与3-叠氮丙胺孵育不会导致融合蛋白的分子量发生变化(图1b)，说明Insp6可以从POI释放CPD，但不会释放胺分子。然而，如图1c所示，将融合蛋白与3-叠氮丙胺和Insp6共孵育，得到的相对分子质量为31970，即31888 (Endo-F3(D165A)的相对分子质量)+ 100(3-叠氮丙胺的相对分子质量)- 18(水的相对分子质量)，23745 (CPD的相对分子质量)，这说明了融合蛋白在CPD自裂解过程中可能发生了酰胺化。为了证实融合蛋白在CPD自裂解过程中发生酰胺化，研究人员进一步进行了对照实验，即先将融合蛋白与Insp6孵育2 h，然后加入3-叠氮丙胺。正如预期的那样，LC-MS分析结果(图1d)与没有3-叠氮丙胺的结果(图1a)一致，表明释放CPD不会将氨基转移到C端，酰胺化是在自裂解过程中发生的。

图1

接着，研究人员对C端修饰条件进行了优化。首先，将模型底物Endo-F3(D165A)-CPD (100 μM)与3-叠氮丙胺(2-50 mM)以及Insp6 (100 μM)在4℃的PBS中孵育。通过LC-MS(图2)反应并且将连接产物或水解产物的百分比进行总结。最终得到结果表明，20-50 mM的3-叠氮丙胺在2小时内完成反应，并得到100%的连接产物。但当3-叠氮丙胺浓度降低到5 mM时，2小时的孵育得到了85%连接产物的产率，而水解产物为15%。进一步将3-叠氮丙胺浓度降低至2 mM时，得到30%的连接产物和70%的水解产物。从这些结果中，研究人员可以得到CPD诱导的羧基末端氨基分解是一个浓度依赖性反应，表明胺和水分子与硫酯中间体之间的竞争反应。此外，研究人员还对Insp6浓度、催化剂种类、缓冲溶液种类等多方面对反应条件进行了优化。

图2

在C端修饰条件优化的情况下，研究人员考察了该方法与各种含胺分子的底物相容性。首先，研究人员将3-叠氮丙胺替换为炔丙基胺、乙二胺、5-氨基戊烷-1-醇、1-氨基-2-甲基丙烷-2-醇、肼等伯胺分子，在Insp6和DMAP存在的情况下与Endo-F3(D165A)-CPD反应。LC-MS分析表明，融合蛋白可以通过这些底物很好地转化为C末端功能化的Endo-F3(D165A)。此外，研究人员还对不同氨基酸的反应能力进行了评估。然而，只有甘氨酸可以连接到羧基端（图5a）。使用二肽Gly-Gly或三肽Gly-Gly- Gly进行的进一步测试显示，这些肽成功地接合到羧基端(图3a)。

图3

基于这些结果，研究人员进一步将CPD融合到更多的蛋白质上，并探索CPD诱导羧基端功能化的可能性，包括针对Her2受体的纳米抗体、GFP、Endo-A、Endo-S2等。将Nb-Az与连接子-药物孵育，从而得到在C端结合药物的纳米抗体药物偶联物，例如，通过连接子得到C端结合MMAE（monomethyl auristatin E，一种细胞毒素）米抗体药物偶联物（图4a），或者合成了纳米抗体-FITC (FITC ，荧光基团)探针（图4b）。

图4

由于Her2 Nb的分子量约为13 kDa，研究人员使用了RP-HPLC来鉴定修饰过程。从HPLC结果中，可以清楚地看出氨基分解或功能化步骤都有很好的产率(图5c)。研究人员将反应混合物中多余的连接子-药物/FITC简单地除去，高效地获得了纯Her2 NDC或Nb-FITC。然后，对Her2阳性癌细胞SK-Br-3和Her2阴性细胞株MDA-MB-231进行体外抗肿瘤活性评价。如图5d, e所示，与裸纳米抗体相比，NDC对Her2阳性细胞系表现出有效的选择性抗肿瘤活性。同时，荧光SDS-PAGE显示FITC成功连接到Nb上(图5f)。然后将获得的Nb-FITC用于共聚焦显微镜测定，根据结果，Nb-FITC可以结合到SK-Br-3细胞的表面，但不能结合到MDA-MB-231细胞的表面(图5g)。这些结果表明，羧基端官能团的结合不会损害目标蛋白的生物学功能，显示了通过CPD诱导的羧基端修饰来开发蛋白质功能化的潜力。

图5

总之，该研究提供了一种化学的、不含酶的C端修饰系统。在这种方法中，我们只需将POIs-CPD与胺和Insp6(一种化学触发剂)一起孵育，就可以实现羧基端功能化，使修饰更加方便。此外，本文提出的方法与含胺的底物兼容，而不是与单一的氨基酸兼容。同时，CPD标签可以提高难以表达的蛋白的可溶性表达，从而为广泛的POI和应用提供可行的解决方案。此外，本文还列举了POIs在不同底物上的C端特异性功能化实例，以及它们在不同生物应用中的应用，如纳米-糖偶联物、纳米-药物偶联物、双异位抗体、C端荧光标记等，展示了该方法的广泛的应用场景，以及在生物技术和医学研究中的潜在的应用空间。

本文作者：LJY

责任编辑：LRC

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42977-x

DOI：10.1038/s41467-023-42977-x