分享一篇近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为“An NIR Fluorescence Turn-on and MRl Bimodal Probe for Concurrent Real-time in vivo Sensing and Labeling of β-Galactosidase”。文章的通讯作者是来自中科院精密测量科学与技术创新研究院的陈世桢研究员。癌症通常与特定生物标志物（如酶、pH、金属离子、氧气、谷胱甘肽 （GSH） 等）水平的改变有关，检测相关生物标志物对癌症的精确诊断和治疗至关重要。酶是生物系统的基本参与者，是各种疾病良好的生物标志物。β-半乳糖苷酶（β-gal）是一种由lacZ基因编码并定位在溶酶体中的必需糖苷水解酶，在原发性卵巢癌细胞中过表达。因此，β-gal有望作为卵巢癌早期诊断的生物标志物，开发用于β-gal检测和成像的探针对于卵巢癌的早期检测至关重要。目前已知的探针结构仅利用单模态成像技术，在灵敏度、分辨率和穿透深度方面存在局限性，难以实现对肿瘤相关生物标志物的精确检测。多模态成像整合了不同成像方式的优势，克服了单模态方法的局限性。其中，近红外成像（NIR）和磁共振成像(MRI)具有出色的组织穿透度和高空间分辨率，可用于对低浓度肿瘤相关生物标志物高度敏感成像，有助于引导肿瘤手术。因此，作者设计并合成了一种新型半乳糖苷酶双模态探针Gal-Cy-Gd-1（图1）。Gal-Cy-Gd-1是一种集成NIR和MR的双模态探针，半乳糖作为β-gal识别位点，通过点击化学将离去基团与MRI顺磁性的Gd-DOTA共轭连接。Gal-Cy-Gd-1对β-gal表现出显著的灵敏度和选择性，相互作用时形成QM的中间结构。该中间结构显示出更高的反应性，使其容易受到外部蛋白质残基的亲核基团攻击。
图1. 用于体内成像的β-gal诱导的NIR/MR双模探针示意图。
首先，作者在体外系统表征了探针Gal-Cy-Gd-1的反应活性。Gal-Cy-Gd-1在水溶液中溶解性良好。在607 nm和656nm处显示两个吸收峰，具有弱的近红外荧光，这是由于半乳糖的存在，阻碍了Cy荧光团内的电荷转移。经β-gal活化后，探针在UV/Vis吸收光谱中表现出时间依赖的位移，达到687nm， LC分析证实了显著的荧光增强。与β-gal孵育80分钟后，紫外/可见吸收和近红外荧光均达到峰值(图2a, b)。然后检测Gal-Cy-Gd-1对溶液中β-gal的敏感性，随着β-gal的升高，荧光逐渐增加。717 nm处的荧光强度与β-gal浓度在0.1 ~ 1.0 U/mL范围内呈良好的线性相关关系，与其他酶和蛋白相比，只有β-gal在PBS缓冲液(pH 7.4)中荧光增强。当D-(+)-核糖核酸-内酯抑制β-gal活性时，荧光和MRI信号均被显著抑制(图2d)。因此，Gal-Cy-Gd-1在PBS缓冲液(pH 7.4)中表现出对β-gal的特异性。说明Gal-Cy-Gd-1 能灵敏响应β-gal，并且能够共价连接到目标酶或其附近选择性酶激活后的蛋白质。为了确认β-gal酶反应后QMs中间产物的形成，作者合成了一个缺乏氨基甲酸酯结构的对照探针Gal-Cy-Gd-2。对β-gal处理前后的样品进行高效液相色谱(HPLC)分析发现，Gal-Cy-Gd-1产生了含有荧光团Cy-Gd-1的混合物(图2e)。而单独Gal-Cy-Gd-2只含有游离荧光团Cy-Gd-2(图2f)。Gal-Cy-Gd-1与β-gal共孵育产生了近红外荧光信号，而β-gal、Gal-Cy-Gd-1、与β-gal共孵育的Gal-Cy-Gd-2以及Gal-Cy-Gd-2条带均未显示荧光(图2g, h)。这些结果表明Gal-Cy-Gd-1具有在选择性酶激活时共价附着于酶或蛋白的能力。在激活位点周围保留更多活化的荧光团，而不受目标酶的亲核残基数量的限制，从而促进体内成像。
图2. Gal-Cy-Gd-1的体外表征。
通过对接计算，Gal-Cy-Gd-1 与β-Gal具有较高的结合活性。结合口袋中的探针与实验结构中的乳糖位置一致。作者研究了与实验结构的乳糖图叠加的对接模式图，在结合口袋中检测到几个关键残基，与红色圈标记的乳糖相同。对接结果和鉴定的关键残基表明Gal-CyGd-1可以紧密地附着在结合口袋中，并占据适当的位置，以促进催化过程（图3）。
图3. Gal-Cy-Gd-1和Gal-Cy-Gd-2与结合袋中乳糖的β-gal对接模式x射线结构。
在证明Gal-Cy-Gd-1共价标记蛋白质的能力之后，作者使用NIR和MRI进行细胞成像，以检测Gal-Cy-Gd-1的β-gal响应。作者用Gal-Cy-Gd-1检测了活SKOV3细胞中β-gal的活性。与Gal-Cy-Gd-1孵育后，细胞内NIR荧光强度逐渐增加，在6小时达到峰值(图4a)。不同时间点的流式细胞术分析也证实了成像结果的可靠性(图4c)。此外，Gal-Cy-Gd-1与经β-gal抑制剂D-(+)-核糖核酸内酯预处理的SKOV3细胞孵育后，近红外荧光最小。为了进一步比较SKOV3细胞的荧光，作者采用流式细胞术验证(图4d)，结果与前期细胞图像一致。Gal-Cy-Gd-1在SKOV3细胞中表现出比Gal-Cy-Gd-2更强的荧光信号，尽管两种探针在水溶液中表现出相似的荧光响应。受上述结果的鼓舞，作者研究了近红外荧光和磁共振双模成像对SKOV3细胞中β-gal活性的影响。图3e显示，Gal-Cy-Gd-1培养的SKOV3细胞的近红外荧光信号明显强于其他对照，这与细胞的共聚焦荧光成像结果一致（图4b）。但抑制剂处理的SKOV3细胞和Gal - Cy - Gd -2孵育的SKOV3细胞MR信号相对较低。这种差异可能是由于SKOV3细胞的纵向弛豫增强，缩短了这些细胞中水质子的T1弛豫时间(图4f)。这些结果表明，Gal-Cy-Gd-1限制了活化荧光团的扩散，从而提高了检测。
图4. 卵巢癌细胞中β-Gal的可视化成像。
为了评估Gal-Cy-Gd-1在体内成像中的适用性，作者使用皮下肿瘤模型研究了β-gal触发的NIR和MRI激活。体内荧光成像结果显示，静脉注射Gal-Cy-Gd-2的小鼠在1小时表现出较强的肿瘤荧光，但在2小时后荧光迅速下降。相比之下，注射Gal-Cy-Gd-1的小鼠肿瘤荧光逐渐增强，在24小时达到峰值，比gal - cy - gd -2处理的小鼠高1.5倍(图5a, b)。静脉注射Gal-CyGd-1 4小时肿瘤内最大信号增强约63%(图5e, f)。H&E染色结果证实该探针具有良好的生物安全性，可用于体内成像。对小鼠解剖的肿瘤进行HPLC分析表明，Gal-Cy-Gd-1在肿瘤中发生反应并锚定在蛋白质上。作者切除主要器官和肿瘤进行离体荧光成像，以研究Gal-Cy-Gd-1和Gal-Cy-Gd-2的分布(图5c, d)。Gal-Cy-Gd-1治疗的肿瘤在所有组织和器官中表现出最亮的荧光。Gal-Cy-Gd-2治疗的肝脏的荧光强度在所有组织中和器官中最高，且远高于肿瘤组织。这些结果证实了在活体小鼠中无创观察到的荧光增强和，表明β-半乳糖介导的荧光反应和酶的自固定有效地激活了Gal-Cy-Gd-1，使得肿瘤中β-半乳糖相关的积累增加。
图5. 小鼠体内内源性β-gal的双模态成像。
最后，作者利用Gal-Cy-Gd-1对原位SKOV3卵巢肿瘤进行可视化和指导切除。静脉注射Gal-Cy-Gd-1后，我们在SKOV3/Luc肿瘤小鼠的左卵巢中观察到近红外荧光，正常小鼠的卵巢荧光信号几乎不可见(图6a)。注射Gal-Cy-Gd-1后卵巢肿瘤区域MR对比度更高(图6b)。近红外荧光和磁共振成像证明了Gal-Cy-Gd-1在活体小鼠卵巢原位肿瘤部位的有效积累。通过尾静脉给药Gal-CyGd-1，注射后10小时，肿瘤部位比周围组织表现出更强的荧光，卵巢肿瘤的边缘清晰可见，Gal-Cy-Gd-1可以用于引导切除肿瘤组织(图6c)。
图6. 原位卵巢肿瘤的双模态成像和荧光引导手术示意图。
综上所述，本文提出了一种可激活的双模态探针Gal-Cy-Gd-1。它可以通过NIR荧光和MRI在体内进行实时β-gal活性成像。它还选择性地标记酶或蛋白质，抑制探针快速扩散并增强MRI信号。同时可以有效地利用Gal-Cy-Gd-1指导小鼠卵巢肿瘤术中切除，实现术中实时可视化。因此，Gal-Cy-Gd-1可作为一种有潜力的辅助肿瘤诊疗分子工具。
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