分享一篇近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.杂志发表题为“Disulfide click reaction for stapling of S-terminal peptides”的研究论文，文章的通讯作者为通讯作者是来自华东师范大学的姜雪峰教授。
多肽能模拟蛋白质-蛋白质相互作用 (protein-protein interactions, PPIs) 序列结构，靶向性结合功能蛋白活性位点，作为抑制剂等，是非常重要的一类药物。但是，线性多肽无法保持它在天然蛋白中的α螺旋结构，呈现多变的构象。研究者们用化学装订的方式，将线性多肽中的两个或者两个以上位点共价连接，能限制多肽的构象，使得它恢复为α螺旋，还能增加多肽的跨膜能力，防止酶解。如图1所示，作者开发了一种可逆装订多肽侧链巯基的方法。进入胞内，装订好的多肽会被谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 还原为线性多肽，发挥功能。如图1(B)所示，作者利用二炔烃和邻苯二甲酰亚磺酰氯反应，制备了一种可逆的双官能团半胱氨酸 (L-cysteine, Cys) 连接子，它的链长、亲疏水性等都是可调的。
图1.可逆肽钉接的二硫键合反应。
作者利用邻苯二甲酰磺酰氯和二炔基类化合物在环境气氛下的反应，获得了一系列二硫亲电连接试剂(图2)。具有正丙基的连接剂3a获得了良好的产率，其e构型通过x射线晶体分析得到证实。为了实现多样化的钉接，在键上组装了不同的取代基，包括N -取代3b、O -取代3c、S-取代3d和酯-取代3e。为了实现可调长度和刚性，设计了扩展连接体3f、3i和芳香取代连接体3j、3o，获得了克级合成的优异产率。其中，含有邻位取代基、间位取代基和对取代基的芳基部分具有良好的相容性，而含有荧光探针基序的芳基部分具有良好的光响应结构。除了双位点的钉接试剂外，还建立了三位点的Cys - Cys - Cys连接物3p和3q，为构建自行车肽提供了良好的潜力。
图2 不同链长、取代基和不同刚性结构的连接子文库。
接下来，作者在水/乙腈混合溶剂将连接子和含2个或者2个以上巯基的多肽混合，装订反应在1 min内完成。作者成功制备了18至32元环的产物，装订反应都十分高效。
图3. 制备高效液相色谱法制备钉接环肽。
为了验证这种钉接方法对肽活性的影响，选择HCT-116结直肠癌细胞靶向的肽QN-16: Ac-QSQQTFCNLWRLLCQN-NH2 (i, i+7)作为前体肽，与多种连接体连接。这种钉接方法以中等到较高的产量高效地获得了含有33到42个环的肽7和7 f (图4 A)。以浓度为20 μM以内浓度对HCT-116细胞进行初步活性试验表明，7a (77.11%)、7b (75.68%)、7c (95.27%)、7d (85.54%)和7f (95.48%)具有较强的抑制活性，7e (54.28%)具有中等抑制作用，而未钉接肽7几乎没有抑制作用。进一步的一半最大抑制浓度(IC50)测试显示，结合肽抑制IC50值:7 a (6.81 μM)， 7 b (13.40 μM)， 7 c (10.80 μM)， 7 d (8.38 μM)， 7 e (19.30 μM)和7 f (7.38 μM)，这与抑制活性一致(图4 B)。对于三半胱氨酸位点装订的双环肽构建，将无保护的尿激酶肽AG-17: ACSRYEVDCRGRGSACG-CONH2和AG-18: AACSRYEVDCRGRGSACG-CONH2通过装订试剂3p、3q进行双环钉接得到双环钉接产物8 a和8 b(图4 C)。
图4. A)钉接肽。B)抗hct -116细胞的生物学特性。C)钉接双环肽。D) 7种不同溶剂体系中钉接肽7a的圆二色性(190-250 nm)光谱。E)线性肽和钉接肽在40% TFE/水溶液中的CD光谱。
作者利用硫氧还蛋白 (thioredoxin, Trx)作为模型蛋白，用TCEP还原蛋白中的二硫键，然后分别与连接子3c、3g制备得到装订后的蛋白，证明该方法不仅适用于短肽，还适用于更复杂的蛋白。如图6(B)所示，装订后的环状多肽能被TCEP还原切除连接子，得到原本的线性多肽，收率都在80%以上。接下来，选择人氧化还原酶蛋白硫氧还蛋白(Trx)进行钉接研究。通过连接剂3c和3g将裸半胱氨酸巯基钉接在裸半胱氨酸巯基上。通过MALDI-TOF-MS就获得了该蛋白的特征分子量(m/z分别为12071和12115);图5A)，证明这种双击反应在复杂的生物环境中具有生物相容性。为了模拟GSH对获得的S - S键的还原裂解，实现体外解钉模型。将钉接肽5b、5y、6B和7f进行TCEP处理，以极好的效率再生天然肽(图6B)。因此，这种解钉方案有望将肽控制递送到癌细胞，其中谷胱甘肽的平均浓度高达10 mM的浓度以释放体内的钉接肽。
图5. A)钉接硫氧还蛋白(人)。B)用TCEP解钉大环肽和再生天然肽。
综上所述，本文提出一种简单、快速、直接、长度和角度可调的天然肽大环化和钉接合成平台。开发了一系列具有不同刚性的可逆钉接试剂，以动态快速的方式连接3 - 18个氨基酸残基，以传递18- 48个约束肽。连接体的几何形状和官能团影响交联效率，为多肽/蛋白荧光标记和双环肽修饰提供了途径。结果表明，该钉接方案可提高线性肽的α-螺旋度和生物活性。解钉接过程进一步使该方案具有释放药物的潜力。
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