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蛋白质组的精准定量为生物体系中的蛋白质组成和功能提供了重要信息。由于许多重要生物学样本不易获得,因此开发对于痕量样本中的蛋白质组分析技术十分重要,目前实现其精确和可重复定量仍然较为困难。
质谱检测组学样品可以通过动态排除模式(排除给定的时间窗口内肽段的重新选择)进行数据依赖性采集(DDA),尽管动态排除更可能鉴定到更多的低丰度蛋白,随机和不可重复的母离子选择经常会限制痕量样品的精准定量,这是因为动态排除可能会造成肽段只发生一次断裂,用于定量的碎片离子只能反映给定时间点的肽段丰度。关闭动态排除功能后,DDA模式或可以克服随机且不可重复的母离子选择和采样,由此增加了低丰度肽段的成功鉴定机会。基于此,作者开发了无动态排除的数据依赖性采集方法,将其命名为turboDDA,改善了痕量蛋白质组鉴定的精确度和可重复性。
首先,作者优化了痕量样品的采集参数,对于痕量未标记的人类细胞样品进行鉴定,作者发现无论是在鉴定的蛋白、肽段或者肽段指纹图谱数量等方面,turboDDA都优于DEDDA,且覆盖了大部分来自DEDDA的鉴定结果。此外,K562细胞中有26个中低丰度蛋白仅通过turboDDA方法被鉴定出来。这些结果表明,turboDDA在痕量样品的蛋白质和多肽鉴定方面具有显著增加的灵敏度。这可能是由于传统的DEDDA方法只收集许多肽的单次扫描,导致对痕量样品的低丰度蛋白质鉴定不足。除了快速扫描TOF仪器,turboDDA对在慢扫描Orbitrap仪器上对痕量样品的鉴定也比DEDDA好。
此后,作者设计iTRAQ标记的三蛋白质组模型(即酵母、人类和大肠杆菌的蛋白质标记样品),评估了痕量样品的定量干扰、准确性、再现性以及不同方法对PIF截断的影响。结果表明,turboDDA可以提高定量准确度和重现性,而更严格的PIF截止导致两种方法的定量更准确,但鉴定肽段也随之较少。
最后,作者将turboDDA策略应用于微量人肺癌细胞样本的差异分析,发现了肺癌潜在的生物标志物和治疗靶点。作者认为基于同位素标记的定量技术与turboDDA相结合在临床样品分析中具有巨大的潜力,可以实现高通量、高精度和高灵敏度的鉴定。由于turboDDA与离子迁移率、MS3碎片化等其他先进技术完全兼容,作者认为将turboDDA与这些技术结合起来,可能会进一步提高蛋白质组学定量的准确性。
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